Бумажная хроматография

               Бумажная хроматография

План 
Введение 
1. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКАЯ БУМАГА 
2. АППАРАТУРА ДЛЯ БУМАЖНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ 
2.1 ПИПЕТКИ ДЛЯ НАНЕСЕНИЯ ПРОБ 
2.2 АППАРАТУРА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ 
2.3 АППАРАТУРА ДЛЯ ЭЛЮИРОВАНИЯ ПЯТЕН 
3. ВЫБОР РАСТВОРИТЕЛЕЙ (ПОДВИЖНОЙ ФАЗЫ) 
4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЕЛИЧИН Rf И Rm ИХ ИЗМЕРЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ 
5. КОЛИЧЕСТВЕННАЯ БУМАЖНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ 
6. БУМАЖНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОРОДСОДЕРЖАЩИХ СОЕДИНЕНИЙ 
7. БУМАЖНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ СОЕДИНЕНИЙ 
Список использованной литературы 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

Бумажная хроматография — метод анализа состава исследуемого образца. Был открыт в 1944 году Констоном, Гордоном, Мартином и Сенджем, которые использовали его для анализа смесей аминокислот. Бумажная хромотография (БХ), вид хроматографии. основанный на различии в скорости перемещения компонентов анализируемой смеси по бумаге в потоке растворителя (элюента). Хроматограммой в этом случае называют картину расположения хроматографич. зон на бумаге после завершения разделения. В БХ используется главным образом спец. хроматографич. бумага, которая должна быть максимально однородной и содержать только целлюлозные волокна. Она может служить неподвижной фазой или инертным носителем неподвижной фазы.  
Как и хроматографию вообще, БХ можно разделить на распределительную, адсорбционную и ионообменную, а также на аналитическую и препаративную. По характеру методики мы различаем также проточную (непрерывную) хроматографию, соответствующую проявительной хроматографии в колонках (с тем различием, что не всегда элюируются все зоны), повторное хроматографирование, когда хроматографический процесс прерывают по достижении определенного положения фронта растворителя, хроматограмму сушат, после чего вновь проводят хроматографирование (иногда по нескольку раз) с той же или другой системой растворителей, и, наконец, одно- и двумерную, круговую и центрифужную хроматографию, а также хроматографию на хроматограммах клиновидной формы. В распределительной хроматографии можно выделить нормальную и обращенно-фазную хроматографию. В последнем случае (в отличие от нормального метода) неподвижная фаза более липофильна, чем подвижная фаза. Отдельные типы БХ подробно рассматриваются ниже. 
 

1. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКАЯ  БУМАГА 
Хроматографической бумагой называют целлюлозную фильтровальную бумагу, отличающуюся особой чистотой и некоторыми особыми свойствами, а также другие типы бумаги, например бумагу из модифицированной целлюлозы, стекловолокна и т. п. Материалом для изготовления нормальной хроматографической бумаги должна служить возможно более чистая целлюлоза. Обычно для этой цели используют коротковолокни-стую целлюлозу, называемую линтером, которая содержит приблизительно 98—99% а-целлюлозы, 0,3—1,0% р-целлюлозы и 0,4—0,8% пентозанов. В пригодной для употребления бумаге иногда имеются примеси, например следы аминокислот, неорганических солей и липофильных веществ (смол и др.). В большинстве случаев эти примеси не мешают хроматографированию, если же они могут повредить, то их надо извлечь из бумаги, промывая ее последовательно разбавленной соляной кислотой, водой или метанолом, ацетоном и т. п., или же использовать имеющуюся в продаже специальную хроматографическую бумагу. Другая важная особенность хроматографической бумаги состоит в следующем: нанесенная на нее жидкость перемещается под действием капиллярных сил по капиллярам, образованным волокнами бумаги. Количественно эта характеристика бумаги определяется скоростью, с которой растворитель проникает в капилляры, и конечной высотой подъема. Эти характеристики капиллярного подъема зависят от плотности и от густоты сетки волокон бумаги. Чем плотнее бумага (а значит, чем она глаже, менее проницаема и менее прозрачна), тем ниже характеристики капиллярного подъема. Чем волокна рыхлее, тем больше высота подъема.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2. АППАРАТУРА  ДЛЯ БУМАЖНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ 
 
Учитывая ослабление интереса к бумажной хроматографии, мы рассмотрим только чаще всего употребляемую, доступную или простую аппаратуру для БХ. Список аппаратуры для БХ включает хроматографические камеры или сосуды, стойки с лотками, пипетки для нанесения проб, приспособления для сушки, пульверизаторы, чашки для обнаружения и пропитки, сосуды для элюента, сушильные шкафы, лампы для облучения хроматограмм, приспособления для измерения Rf, а также планиметры и денситометры для количественных определений, копировальные машины и т. д. 
 
Хроматографические камеры значительно различаются по форме и размерам, и это в большой степени зависит от характера процесса хроматографирования (восходящее, нисходящее, круговое, двумерное, препаративное). Для восходящего, а также двумерного хроматографирования на короткие расстояния обычно пригоден любой цилиндрический 
сосуд большого диаметра, например большой и высокий химический стакан, большая широкогорлая склянка, стеклянная банка из-под маринада и т. п. (см. рис. 1). Короткие и не слишком широкие хрома-тограммы можно получать методом восходящей БХ даже в конической колбе, а микрохроматограммы — в пробирках (рис. 2). Можно свернуть хроматограмму в цилиндр и закрепить по краям так, что она будет стоять, опираясь на дно камеры, и будет погружена в хроматографический растворитель, или как-то подвесить ее, чтобы нижняя часть была погружена в растворитель, находящийся на дне сосуда. Если для этого используют коническую колбу, узкий цилиндр или пробирку, то можно подвесить полоску бумаги в пробирке (укрепив в ней проволочный крючок или разрезав резиновую пробку на две половинки и зажав бумагу между ними и т. п.). Если хроматографической камерой служит сосуд с широким отверстием, можно укрепить над отверстием тонкую проволоку или крепкую нитку и на ней подвесить хроматограмму. Можно закрепить два кусочка резиновой трубки на концах стеклянной палочки длиной немного меньше внутреннего диаметра цилиндрической камеры таким образом, чтобы палочка в результате стала чуть длиннее. Затем надо вставить эту палочку в цилиндр (поперек него и немного ниже его верхнего края), чтобы она держалась достаточно плотно и чтобы на ней можно было подвесить полоску бумаги.  
Различные виды камер для восходящей бумажной хромотографии. 
Для нисходящей хроматографии нужны более широкие и высокие камеры, потому что в них нужно еще поместить стойку или держатель для лотка, в который наливается хроматографический растворитель и помещается конец полоски бумаги. Предложены различные типы камер, лотков, подставок, держателей, крышек и т. д. На рис. 4 показаны два типа аппаратуры для нисходящей хроматографии. Желательно, чтобы хроматограмма (полоска бумаги), высовывающаяся из лотка,, направлялась далее с помощью горизонтально расположенной (примерно на высоте уровня растворителя) стеклянной палочки, потому что это предохраняет от опасности перетекания растворителя через хроматограмму. Перетекание растворителя,, вызванное стеканием или сдуванием, или неосторожным добав- 
лением растворителя, а иногда самими капиллярными силами, приводит к порче хроматограммы. При наличии такого устройства стартовая линия должна находиться непосредственно под палочкой. Для двумерной БХ на широких листах или препаративной БХ применяют большие камеры и чаще всего проводят нисходящее элюирование.  

Ввиду того что на таких длинных листах процесс разделения продолжается иногда много часов (в зависимости от растворителя и марки бумаги) и поэтому метод БХ не может конкурировать со скоростной ТСХ (в тех случаях, когда оба метода можно было бы использовать с одинаковым успехом), Буш и Кроушоу предложили методику скоростной БХ. Эта методика предусматривает применение более узких камер , горизонтального хроматографирования (возможного благодаря наличию специальной металлической рамки), тщательного насыщения атмосферы камеры парами растворяющей системы (применяются липофильные, маловязкие, летучие и быстро впитываемые растворители), а главное — предварительной пропитки бумаги водной неподвижной фазой. Поскольку разделение этим методом ведется на более коротких полосках бумаги, то требуется меньшее количество хроматографируемого вещества, которое наносят на меньшую площадь у стартовой линии (т. е. в виде пятен меньшего размера). 
 
Для круговой хроматографии используют специальные камеры, основой для которых могут служить большие чашки Петри или эксикаторы. В первом случае в центре круглого бумажного фильтра помещают тампон, приготовленный из плотно скатанного кусочка фильтровальной бумаги  или из чистого волокнистого материала, промытого растворителем. Можно также использовать опрокинутую маленькую стеклянную воронку с обрезанным до требуемой высоты носиком, причем эту воронку заполняют хлопковой ватой таким образом, чтобы из носика воронки высовывался и касался центра бумажного фильтра маленький тампончик. При использовании эксикатора элюирующий растворитель очень медленно выпускают по каплям на тампон (приготовленный, как указано выше), с которого нужное количество растворителя впитывается круглым бумажным фильтром, а избыток растворителя стекает на дно эксикатора. 

Проще всего подвесить хроматограмму в вытяжном шкафу и держать ее там, пока она не высохнет. Если растворители недостаточно летучи, то надо пользоваться нагретым до нужной температуры сушильным шкафом (особенно эффективны сушильные шкафы с циркулирующим теплым воздухом), в котором следует подвесить хроматограммы для сушки. Если сушка хроматограмм проводится в сушильном шкафу, необходимо выполнять требования техники безопасности, обязательные при работе с летучими, воспламеняющимися или взрывоопасными растворителями. Часто используют батарею инфракрасных ламп или даже обычных электрических ламп, расположенных так, чтобы равномерно обогревалась большая поверхность. Хроматограммы меньшего размера можно быстро высушить (даже если разделение велось малолетучим растворителем) под вытяжным колпаком, если просто перемещать их в горизонтальном направлении над горячей поверхностью. При этом необходимо следить, чтобы полоска бумаги находилась достаточно высоко над этой поверхностью, иначе бумага может воспламениться или обуглиться. При наличии некоторого опыта этот метод оказывается наиболее простым. 
 
2.1 ПИПЕТКИ ДЛЯ НАНЕСЕНИЯ ПРОБ 
В продаже имеются различные микропипетки емкостью от 1 до 50 мкл, предназначенные для нанесения проб. Наиболее простыми являются самозаполняющиеся пипетки, т. е. капиллярные пипетки с сужающимся или резко расширяющимся капил-ляром, в которых или сразу полностью прекращается подъем жидкости, или он продолжается с сильно замедленной скоростью (рис. 10,6, в). Тонкие стеклянные капилляры очень удобны, дешевы, и их легко можно изготовить. Обычно наносят 5— 10 мкл. Пипетки такого объема легко изготовить, вытягивая стеклянные трубки в капилляры диаметром около 1 мм с суженным кончиком. Кончик капилляра отрезают, а капилляр калибруют. Калибровку (конечно, не особенно точную, но достаточную для большинства хроматографических операций) можно легко провести с помощью готовой градуированной пипетки емкостью 0,1 мл. Эту пипетку заполняют до метки метанолом и затем, держа обе пипетки почти горизонтально, вводят в капилляр требуемый объем метанола (10 мкл) из кончика градуированной пипетки, слегка наклоняя ее. Положение уровня жидкости в капилляре при ее объеме 10 мкл отмечают, нанося метку восковым карандашом или царапину карборундовым острием, наклеивая нитку и т. д., и после сушки капиллярная пипетка готова к употреблению (рис. 10,г). Если предстоит отбирать из длинных пробирок, глубоких или узкогорлых колб, желательно не отрезать капилляр от трубки, из которой он был вытянут, так как тогда пипетка будет достаточно длинной и более удобной. 
2.2 АППАРАТУРА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ 
Уф-лампы. Обычно используют ртутные лампы с фильтрами, пропускающими излучение с длиной волны около 365 нм (фильтр Вуда), например лампы Phillips, Philora HPW, Luma HgU, или с длиной волны 254 нм (Mineralite, Chromatolite). 
Пульверизаторы. В литературе описано большое количество видов пульверизаторов. Их легко приобрести, и мы не будем описывать их.  

Вместо нанесения реагента на бумагу путем опрыскивания иногда целесообразнее погружать хроматограммы (на полосках или даже на листках бумаги) в раствор реагента. Для этой цели служат специальные неглубокие лотки или чашки. При таком методе обнаружения достигается более равномерное смачивание хроматограммы и, следовательно, более равномерное окрашивание пятен. 
Аппаратура для копирования хроматограмм. Получить копии хроматограмм, которые постепенно выцветают или даже разрушаются, можно, фотографируя хорошо освещенную хроматограмму с помощью фотокамеры; в некоторых случаях возможно прямое копирование хроматограммы на фотографический материал; кроме того, можно воспользоваться такими методами, как рефлексная фотография или ксерокопирование. Если фотографировать хроматограмму не обязательно, то можно скопировать ее вручную на тонкую прозрачную бумагу, отмечая окрашенные пятна цветными карандашами. Этот метод копирования относительно быстрый, наиболее простой, а учитывая возможность воспроизведения цветов, и наиболее точный. 
Измерение значения Rf 
Согласно определению, величина Rf представляет собой отношение расстояний от центра пятна и фронта растворителя до стартовой линии (см. ниже); эти расстояния обычно измеряют линейкой. Для непосредственных измерений, при которых не требуется вычислять отношение, разработаны и изготовлены растягивающиеся упругие линейки , так называемые партогриды . С их помощью можно сразу отсчитывать значения Rf. 
 
Рис. 12. Приспособления для измерения Rf. 
а — упругая (растягивающаяся) полоска белой резины длиной около 15 см со шкалой, разделенной на 100 частей; б — партогрид из прозрачного пластика (вершину помещают иа стартовой линии, а линия Л^=1 на партогриде должна пересечь фронт растворителя). 
 
2.3 АППАРАТУРА ДЛЯ ЭЛЮИРОВАНИЯ ПЯТЕН 
Участок бумаги, содержащий пятно, или зону, вырезают, как показано на рис. 13, и прямолинейный край этого кусочка помещают между двумя маленькими стеклянными пластинками (покровными стеклами от микроскопа), которые затем погружают в чашку Петри таким образом, чтобы острый край кусочка бумаги был направлен назад, как показано на рис. 14. Если налить в чашку растворитель с очень высокой элюирующей способностью, то под действием капиллярных сил он проникает между пластинками и впитывается в бумагу, элюируя пятно; элюат при этом каплями стекает с бумаги в подставленный маленький стаканчик. 
Если надо провести элюирование всей зоны, например с широкой препаративной хроматограммы, то можно ее вырезать, плотно навернуть на кусок прочной стеклянной палочки, покрытый более широкой полоской полиэтиленовой пленки, и элюировать получе полученный таким образом бумажный цилиндр, как это делают в колоночной хроматографии  
 
 
3. ВЫБОР РАСТВОРИТЕЛЕЙ (ПОДВИЖНОЙ ФАЗЫ) 
Чтобы результаты хроматографирования были воспроизводимыми, необходимы очень чистые растворители с постоянными характеристиками. Иногда наличие даже 1 % примеси в растворителе может быть причиной значительного изменения значений Rf хроматографируемых соединений. Например, у абсолютного хлороформа элюирующая способность меньше, чем у медицинского хлороформа, содержащего в качестве стабилизатора около 2% этанола. Подобное же влияние оказывает на этилацетат добавка воды: этилацетат легко гидролизуется и образующиеся при гидролизе этиловый спирт и уксусная кислота значительно повышают полярность растворителя. Для обнаружения также требуются высококачественные растворители; примеси могут подавлять флуоресценцию или каким-либо образом нарушать действие обнаруживающих реагентов. 
При подборе растворителей следует руководствоваться общим правилом (тем самым правилом, которое было известно еще алхимикам) — подобное растворяет подобное. Если анализируемые соединения значительно отличаются от растворителя по гидрофильным свойствам или полярности, то нельзя ожидать хороших результатов. Такие соединения или останутся на стартовой линии или будут перемещаться вместе с фронтом растворителя. Растворители обычно классифицируют по элютропным или миксотропным рядам. Если элюирующая способность растворителя заранее не определена экспериментально, то следует руководствоваться следующим основным принципом, применимым также при определении полярности или гидрофильно-сти растворенных веществ: алифатические углеводороды считаются крайними членами ряда, (предположим, начинают его), потому что они наиболее липофильны, т. е. совершенно негидрофильны и неполярны, а замыкает такой ряд вода, поскольку она наиболее гидрофильный и высокополярный растворитель. Степень неполярности парафиновых углеводородов и вообще органических соединений можно, как правило, уменьшить, вводя заместители. Наличие пи-электронов двойной связи в растворителе приводит к увеличению его полярности и элюирующей способности и к уменьшению элюируемости вещества на полярных сорбентах или на полярных неподвижных фазах. Так, например, бензол — значительно лучший элюент, чем циклогексан. Распространенный заместитель, не слишком увеличивающий гидрофильность,— это хлор (хотя он может значительно увеличить дипольный момент вещества); другие галогены едва ли имеет смысл рассматривать в этой связи. Например, тетрахлорметан неполярен, хотя содержит сильно электроотрицательные атомы хлора; его молекула симметрична и поэтому не имеет дипольного момента. В то же время хлороформ значительно более полярен благодаря низкой степени симметрии его молекулы и значительному дипольному моменту, а его элюирующая способность значительно выше, чем у тетрахлорметана. Гидрофильные свойства еще более усиливают простые эфирные группы, сложные эфирные группы, оксогруппы и гидроксильные группы (перечислены в порядке усиления влияния). Соединения с нитрогруппой рассматриваются редко, хотя наличие этой группы значительно усиливает полярный и гидрофильный характер вещества; подобным образом действует и тиольная группа. Аминные и карбоксильные группы очень высокополярны даже в неионизованном виде, а в ионизованном состоянии соответствующие соединения становятся крайне гидрофильными. Важную роль играет соотношение между длиной алифатической цепи и числом заместителей. Например, две или три простые эфирные группы в молекуле оказывают такое же влияние на гидрофильный характер вещества, как и гидроксильная группа. Так, например, диэтиловый эфир не смешивается с водой, а диоксан смешивается. Однако для оценки или предсказания гидрофильного характера веществ не существует строго количественных и общих правил. 
На практике возможны два основных способа подбора растворителей. а. Поиск по литературным источникам таких систем, в которых данное вещество уже хроматографировали, и подбор по опубликованным значениям Rf и другим данным наиболее подходящей системы. 
б. Если данное вещество ранее вообще не хроматографировали, то находят такие системы, в которых хроматографировали подобные вещества (в частности, подобные по степени гид- 
рофильное™), и тогда можно применять метод проб и ошибок. 
Если вещество совершенно гидрофильно, т. е. его нельзя экстрагировать из водного раствора даже таким относительно полярным растворителем, как н-бутанол (примеры таких веществ— аминокислоты, сахара), то надо использовать растворяющие системы с высоким содержанием воды, например насыщенный водой втор-бутанол (он может содержать до 30% воды), или верхнюю фазу смеси н-бутанола, уксусной кислоты и воды в соотношении 4:1:5, ставшей классической (система Партриджа), или систему изопропиловый спирт — аммиак (7:3 или 8:2 и т. п.), или 15%-ную уксусную кислоту. Среднегидро-фильными считаются вещества, которые хорошо экстрагируются из воды этнлацетатом, хуже эфиром или хлороформом и не экстрагируются бензолом и петролейным эфиром. Для их хроматографирования подходят системы, содержащие растворители средней полярности, например бутилацетат, изопропиловый эфир или хлороформ, часто содержащий добавки малых количеств полярных растворителей или даже воды. Для хроматографирования соединений, очень плохо растворимых в воде, но хорошо растворимых в липофильных растворителях, основными компонентами подвижной фазы служат бензол, циклогексан, тетрахлорметан, толуол и т. п. Для хроматографирования соединений совершенного липофильного характера (жирные кислоты, стерины, каротиноиды и др.) следует применять обращеннофазные системы, в которых липофильный растворитель (парафиновое масло, керосин, силиконовое масло, каучук и т. п.) используют как неподвижную фазу, а обводненные спирты и подобные им полярные растворители — в качестве подвижных фаз. При работе с этим типом веществ целесообразно также применять в качестве неподвижной фазы бумагу, пропитанную нелетучими органическими растворителями, которые не смешиваются с липофильными жидкостями. К таким растворителям относятся, в Частности, формамид, диметилформамид, этиленгликоль, пропйленгликоль, бромнафталин. 
При подборе растворяющих систем можно использовать таблицу в которой приведен миксотропный ряд растворителей. Если имеется вещество с совершенно неизвестной структурой и природой, то полезно сначала попробовать провести хроматографирование его в каком-либо растворителе из средней части таблицы, не забывая привести бумагу в равновесие с парами воды. Если в этом растворителе получается очень высокое значение Rf, это означает, что испытуемое вещество слишком липофильно по отношению к данному растворителю, и, следовательно, для хроматографирования данного вещества надо использовать еще более липофильный растворитель, т. е. какой-либо растворитель, расположенный внизу таблицы. Если, наоборот, значение Rf в первом растворителе слишком низко, то это означает, что используемое соединение слишком гидрофильно для этого растворителя и, чтобы улучшить разделение, необходим более полярный растворитель, т. е. расположенный вверху таблицы. Чтобы решить, с какого растворителя начинать испытания, если известен элементный состав вещества, удобно использовать атомарное отношение С/О — отношение числа углеродных и кислородных атомов в молекуле. Если это отношение мало, следовательно, вещество гидрофильно, и наоборот . Для соединений, содержащих азот или серу, можно условно считать, что один атом азота приблизительно соответствует двум атомам кислорода, а один атом серы одному атому кислорода. 
 
После того как найден растворитель, при элюировании которым вещество не остается у стартовой линии и не движется вместе с фронтом этого растворителя, а остается где-то близко к середине хроматограммы, может оказаться, что данное вещество все-таки не отделяется от какого-либо другого компонента. В таком случае можно надеяться, что эти два вещества удастся разделить другим растворителем с подобной полярностью. С этой целью полезно испробовать растворители, одинаковые по разделяющей способности, иначе говоря, такие растворители, в которых константы распределения или значения Rf разделяемых веществ очень близки к этим величинам в первой растворяющей системе. В подобных растворителях степень разделения двух данных компонентов может быть значительно лучше. Конечно, такие растворители не должны слишком сильно отличаться по полярности, и в таблице они должны быть расположены близко друг к другу. 
Здесь следует подчеркнуть, что поскольку в БХ мы почти всегда имеем дело с распределительным принципом хроматографии (т. е. с жидко-жидкостной хроматографией), то используемые растворители необходимо насыщать водой, бумага также должна быть достаточно влажной. Далее, если нужно подобрать несколько более или несколько менее полярный растворитель, то не всегда следует искать растворитель, отличный от исходного. Полярность растворяющей системы можно подогнать, добавляя какой-либо другой сильнополярный или неполярный растворитель. Обычно добавляют небольшие количества сильнополярных растворителей к неполярным растворителям. 
Даже если удалось найти такой растворитель или такую смесь растворителей, в которой анализируемые соединения имеют достаточно различающиеся значения Rf, пятна этих соединений могут оказаться вытянутыми, и это снизит эффективность и качество разделения. Причиной образования таких вытянутых пятен может быть слишком низкая растворимость разделяемых веществ в использованной растворяющей системе, слишком высокая концентрация вещества в пробе, адсорбция вещества на целлюлозе или диссоциация веществ в процессе их хроматографирования. В первом случае можно улучшить форму пятна и, таким образом, улучшить разделение, подобрав другой растворитель, в котором растворимость данного вещества выше, или найдя более чувствительный метод обнаружения, который позволит уменьшить количество вещества в пробе. Адсорбцию обычно можно подавить, добавляя более полярный компонент к растворяющей системе, лучше смачивая бумагу или пропитывая ее полярным органическим растворителем в качестве неподвижной фазы. В случае диссоциации хроматографируемых веществ можно улучшить форму пятен, добавляя к растворяющей системе более сильную кислоту или основание (преимущественно летучие). Зто приведет или к полной диссоциации вещества, или к полной ассоциации его. В первом случае хроматографируются не нейтральные молекулы, а ионы, которые обычно очень сильно полярны, поэтому можно использовать более полярные растворители, не опасаясь адсорбции. 
 
Во втором случае остаются недиссоциированные формы веществ, которые всегда более липофильны, и поэтому для хроматографии можно применять более липофильные растворители. При этом будут играть большую роль структурные различия веществ и будут достигнуты большие различия в значениях Rf. Очевидно, что правильный выбор величины рН неподвижной фазы также важен для получения хорошего разделения веществ, которые могут диссоциировать. 
При подборе растворяющих систем, одинаковых по разде^ ляющей способности, для разделения нейтральных веществ полезно учитывать электроно- или протонодонорный или акцепт торный характер растворителя и растворенного вещества. Протоноакцепторные соединения, в частности кетоны, сложные и простые эфиры, обладают большим сродством к растворителям с донорными свойствами, а именно хлороформу, спиртам, фенолам и т. п., сильнее притягиваются к ним и легче переносятся ими и наоборот. Поэтому при перемене растворителя иногда может измениться порядок элюирования веществ.  

4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ  ВЕЛИЧИН Rf и Rm ИХ ИЗМЕРЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ 
На полоске фильтровальной бумаги отмечают карандашом стартовую линию на расстоянии примерно 2— 10 см от края полоски и на эту линию наносят каплю раствора тех веществ, которые надо разделить. Когда растворитель испарится и пятно высохнет, полоску кладут в лоток и переносят в хроматографическую камеру , где ее выдерживают до достижения равновесия, а затем наливают в лоток нуж ный растворитель. Под действием капиллярных сил растворитель поднимается вверх по бумаге. Когда фронт растворителя достигнет требуемого уровня, полоску вынимают, сразу отмечают положение фронта, дают растворителю испариться, после чего на полоске проводят обнаружение пятен. Получают хрома-тограмму. Если растворитель правильно подобран, то пятно не располагается ни у стартовой линии, ни у фронта растворителя, а находится где-то между ними. Расстояние между пятном и стартовой линией зависит от природы растворителя, продолжительности элюирования, степени насыщенности атмосферы камеры парами растворителя, влажности бумаги или атмосферы камеры, типа бумаги, температуры и т. д., но главным образом от природы, т. е. от структуры вещества. Это расстояние является типичной характеристикой определенного вещества, которая остается постоянной при постоянных условиях хроматографиро-вания (см. выше). Поскольку растворитель может перемещаться на различные расстояния при восходящем или нисходящем хроматографировании, расстояние от стартовой линии до пятна характеризуют относительной величиной — отношением указанного расстояния к расстоянию от стартовой линии до фронта растворителя. Величина Rf данного вещества определяется по формуле 
Вместо величины Rf иногда используют величину Rx, где X— какое-то известное вещество, применяемое в качестве стандарта. Значение Rx данного вещества выражает отношение расстояния от стартовой линии до пятна данного вещества к расстоянию, пройденному стандартным веществом X от стартовой линии. Эту величину используют преимущественно в проточной хроматографии, где растворитель, достигнув края бумаги, стекает с него, так что расстояние между фронтом растворителя и стартовой линией измерить нельзя, но можно определить расстояние, пройденное стандартным веществом. Поэтому стандартное вещество не должно перемещаться по хроматограмме слишком быстро, так как иначе оно тоже может стечь с бумаги. 
К величинам Rf в круговой хроматографии применимо следующее соотношение : 
Rf(круг.)=Rf (лин.)  
 
При многократном хроматографировании, при котором п раз проводят элюирование одним и тем же растворителем, можно, «еали известна величина Rf однократного элюирования, определить с помощью уравнения, предложенного Джинсом, окончательную величину Rf  
Rf=1-(1-Rf)n  
Величины Rf могут изменяться только в пределах от 0,00 до 1,00, и чем ближе эти величины к нулю или единице, тем хуже разделение для данного вещества.  
Хоу разработал метод хроматографического определения числа карбоксильных групп в молекулах кислот. Он использовал две растворяющие системы: 1) м-пропиловый спирт — аммиак (7 : 3) и 2) н-про-пиловый спирт —сернистая кислота (7:3). В составе раствори* ющих систем использовались летучие основания и кислоты, ко торые легко испаряются при сушке хроматограмм; благодаря этому можно затем применять растворы индикаторов для обнаружения пятен кислот. Измерив величины R¡ большого числа кислот в этих системах, Хоу построил кривые изменения Rf в кислой системе в зависимости от величин Rf в щелочной системе и в результате получил зоны монокарбоновых (7), дикарбо-новых (2) и трикарбоновых (3) кислот и кислот с более высоким содержанием карбоксильных групп. Нейтральные вещества располагаются на этой диаграмме, как и предполагалось, по диагонали . Таким образом, достаточно измерить величины Rf неизвестного вещества в двух указанных системах и установить, в какую зону диаграммы оно попадает, чтобы определить, сколько карбоксильных групп содержится в молекуле этого вещества. Положение немного усложняется, если анализируются амфотерные соединения, однако и в этом случае при определенных условиях можно применять указанный метод.