Поверхности активные вещества

В живой материи белки играют особую роль, так как они представляют собой один из незаменимых ее компонентов.

Установлено, что как химические и физические свойства, так и биохимические функции белка в большей степени определяется его конформацией [1 2 3]. Нативные формы белков и нуклеиновых кислот характеризуются чрезвычайно специфическими конформациями, которые сравнительно легко могут быть нарушены мягкими методами обработки. В результате происходят резкие изменения физических и химических свойств белка, протекающие однако, без изменения их ковалентных связей. Такие изменения объединены под общим названием «денатурация», представляет большой интерес, так как проявляют свет на силы, ответственные за сохранение макромолекул в их нативных конформациях, имеющих столь огромное значение для их биологических функций.

Денатурация белка может происходить в значительной мере также при взаимодействии на него различных поверхностно-активных веществ (ПАВ). В связи с этим взаимодействие белков с ПАВ в водных растворах изучается давно.

В настоящее время представления о механизме комплексообразования в системе белок-ПАВ детализируется. Уже сравнительно давно было известно, что взаимодействия белков с ПАВ реализуется, в основном за счет гидрофобных и электростатических взаимодействий. Однако эти работы имеют феноменологичный характер и посвящены главным образом, определению количества связанного ПАВ для конкретного белка или установлению конформации белка в присутствии денатурирующего агента.

При значениях рН ниже изоэлектрической точки (ИЭТ) белка анионные детергенты электростатически связываются с катионными группами и приводят их к осаждению. При наличии избытка детергента количество его ионов, связанных с белком, возрастает и становится кратным числу, требующихся для нейтрализации катионных групп. Этот эффект объясняют связыванием с белком полимолекулярных мицелл детергента, а также взаимодействием парафиновых цепей детергента с неполярными группами белка. Так, реакция β-лактоглобулина с октилбензосульфонатом идет в три стадии. Сначала несколько молекул детергента связывается своим «хвостом», т.е. парафиновыми цепями, с гидрофобными группами белка. При добавлении большого количества детергента его молекулы связываются «головной частью», т.е. анионом сульфоната. На третьей же стадии образуются мицеллы. II и III стадии взаимодействия детергента с белком приводят к улучшению его растворимости в воде.

Катионные ПАВ вызывают осаждение белка в щелочной области рН, когда карбоксильные группы белка имеют максимальный отрицательный заряд.

Особенностью действия ПАВ на белки является то, что они оказывают денатурирующее действие при относительно низких концентрациях по сравнению с такими низкомолекулярными денатурирующими реагентами, как мочевина и солянокислый гуанидин.

В противоположность мочевине и сходными с ней веществам ПАВ не конкурируют с пептидными группами за образование водородных связей. Их влияние, следовательно должно ограничиться боковыми цепями, и физические изменения, индуцируемые ими в белках, в основном, обусловлены изменениями третичной структуры последних.

В показано, что структура белков с высоким содержанием спиралей обычно изменяется намного меньше под действием детергента, чем структура неспиральных белков. Установлено также, что связывание додецилсульфоната натрия (ДДС) рибонуклеазой (белок с низким содержанием спиралей) увеличивается после расщепления дисульфидной связи.

Для определения природы сил, обуславливающих образование комплекса белок – ПАВ, авторы работ изучали влияние ионной силы и рН раствора на адсорбцию ПАВ белками. Ими показано, что белки, независимо от их структуры, связывают одинаковое количество анионного ПАВ – ДДС. При концентрации водного раствора ПАВ менее 8*10-4 моль/л около десяти исследованных белков связывают 0,4 г детергента на 1 грамм белка, а при концентрациях детергента более 8*10-4 моль/л количество связанного детергента резко возрастает и составляет 1,44 г на 1 г белка

Также было замечено, что связывание ДДС не зависит от общей концентрации ПАВ в растворе, а обусловлено изменением концентрации его мономолекулярной фазы. Это позволило авторам этих работ сделать вывод о том, что белки способны связывать только мономерную форму детергента и не связывать мицеллы.

Как уже подчеркнуто, взаимодействия белков с поверхностно-активными веществами реализуются, в основном, за счет гидрофобных и электростатических взаимодействии .Отмечено, что характер взаимодействия и состав образующихся комплексов могут оказывать специфическое влияние различные факторы, в том числе соотношение концентрации белка и ПАВ, а также фазовое соотношение ПАВ (молекулярное или мицеллярное) в растворе.

В работе для выяснения влияния фазового состояния ПАВ на комплексообразование с белком проведено исследование изотерм связывания октилбензолсульфоната натрия альфа-химотрипсином из молекулярных и мицеллярных растворов ПАВ. Авторы показали, что насыщение белковой глобулы молекулами ПАВ, т.е. предельное связывание при относительно низких соотношениях ПАВ-белок, достигается для мицеллярного состояния гораздо раньше, чем для молекулярно дисперсного раствора. Объясняют это непосредственным взаимодействием мицеллы ПАВ с макромолекулами белка. Так как мицеллы ПАВ и глобулы белка представляют собой примерно одинаковое по размеру гидратированные частицы лиофильных дисперсных систем, то в этом случае авторы заключают, речь идет не об адсорбции, а об образовании смешанных ассоциатов, состоящих из мицелл и глобулы белка.

Отмечено, что на начальных стадиях взаимодействия определяющим является электростатическое взаимодействие. Локализация большого числа молекул ПАВ в близи макромолекулы белка обеспечивают быстрое и термодинамически наиболее выгодное взаимодействие молекул детергента с белком. Кооперативное возникновение мест связывания вызывает конформационный переход полипептидной цепи и возникновение смешанных мицелл, в состав которых входит полипептидная цепь с более рыхлой клубкообразной пространственной укладкой и мицеллы, связанные с боковыми группами полипептидной цепи за счет гидрофобных взаимодействий молекулы ПАВ. Более резкое увеличение степени связывания для мицеллярной системы свидетельствуют о небольшой кооперативности конформационного перехода альфа-химотрипсина при взаимодействии с мицеллами ПАВ, нежели с его молекулами.

Связывание малых количеств ПАВ белками, осуществляется, в основном, по гидрофобному механизму аналогично взаимодействию углеводородов с белками в водных растворах.

Действие же больших количеств ПАВ на белок аналогично денатурирующему действию рН. Сравнение дифференциальных спектров модельных смесей аминокислот, характеризующих содержание тирозина и триптофана в альфа-химотрипсине в присутствии ПАВ, и соответствующих спектров белка подтверждает вывод об образовании смешанных мицелл (белок-ПАВ) при больших степенях связывания детергента, т.к. при этом состояние хромофорных групп отвечает более неполярному окружению чем вода.

Конформационный аспект взаимодействия белков с ПАВ исследован, главным образом, на примере ДДС. При введении в раствор белка (гистоны, рибонуклеаза, трипсин и др.) наблюдается увеличение степени спиральности макромолекулы при одновременном понижении содержания неупорядоченной конформации. Так, Йиргенсонс, исследуя спиралеобразующую способность детергентов – децилсульфоната (ДС) и додецилсульфоната натрия (ДДС), показал, что добавление уже небольших количеств ПАВ к раствору белка вызывает осаждение последнего вследствие электростатического взаимодействия между положительно заряженными макромолекулами белка и отрицательно заряженными мицеллами ПАВ. В избытке детергента комплекс растворяется.

В некоторых белках связывание ионогенных ПАВ индуцирует не спирализацию, а наоборот, разрушение спиральной структуры. Своеобразная третичная структура белка способствует тому, что он взаимодействую с различными нерастворимыми веществами углеводородной природы, солюбилизирует их. В особенности это относится к взаимодействию белков с ПАВ. При этом ориентация их такова, что своей гидрофобной частью они проникают внутрь белковой глобулы, гидрофильная же часть молекул находится на поверхности глобулы, сольватируемой водой. Естественно, что поглощение ПАВ изменяет третичную структуру белков и влияет на устойчивость их конформации.

Как видно из обзора литературы по взаимодействию белков с дифильными ионами ПАВ, экспериментальные данные по связыванию последних биополимерами и их интерпретация столь же противоречивы, как и данные по белок – липидным взаимодействиям.

В связи с этим авторы пришли к выводу о моделировании взаимодействия белок-детергент, заменив белки на полипептиды, представляющие собой гомополимеры одной из альфа-кислот.

Показано, что при взаимодействии липосом с полипептидами происходит изменение конформации макромолекул и образование комплекса, как пологают авторы, обусловленное как электростатическими, так и гидрофобными взаимодействиями. Так, например, образование комплекса полипептид – липид не наблюдается при тех значениях рН раствора, при которых исследуемый раствор не заряжен или же заряжен одинаково с липидом. Исследуя взаимодействия липосом с полилизином, полиорнитином сополимерами глутаминовой кислоты с аланином обнаружили увеличение спиральности полипептидов. Однако, механизм образования комплекса авторами не рассматривается.

3.2 Ассоциация синтетических полиэлектролитов с поверхностно активными веществами

Многие физиологически активные вещества представляют собой дифильные ионы и их взаимодействие с белками, нуклеиновыми кислотами, полисахаридами и другими биополимерами лежит в основе важных жизненных процессов. Взаимодействие водорастворимых синтетических полиэлектролитов (СПЭ) с ПАВ рассматривается как новый тип макромолекулярных реакции. Продукты этих реакции обладая уникальными свойствами, существенно отличными от свойств исходных компонентов, находят широкое применение в технике, медицине и других областях.

Механизм и природа взаимодействий между функциональными группами водорастворимого СПЭ и низкомолекулярного соединения (ПАВ, краситель, лекарственное вещество и т.д.) могут быть различными в зависимости от природы взаимодействующих компонентов: ван-дер-ваальсовые, электростатические, ион-дипольные, гидрофобные взаимодействия, водородные связи. Так, при взаимодействии полимерных и кислот и оснований с катионными, анионными или неионными ПАВ образуются компактные структуры, стабилизированные электростатическими и гидрофобными взаимодействии, водородными связями.

Взаимодействие между полиэлектролитами и противоположно заряженными ПАВ в основном электростатическое. Это сильное взаимодействие вызывает ассоциацию при очень низких концентрациях ПАВ, известных как критическая концентрация агрегации (ККА), которая обычно ниже критической концентрации мицелообразования (ККМ) свободного ПАВ. Дальнейшее добавление ПАВ приводит к фазовому разделению. Максимальный выход осадка имеет место при отношении заряда ПЭ и ПАВ около 1:1. В зависимости от природы электролита дальнейшее добавление избытка ПАВ может вызвать растворение осадка. Следовательно, структура и условия существование комплексов полимер - ПАВ будут определяться соотношением полимер – ПАВ, что связано с образованием стехиометричесого или нестехиометрического комплекса. Структура полимерного комплекса зависит от такой важной характеристики ПАВ как критическая концентрация мицелообразования (ККМ).

В разбавленных растворах при добавлении к полиэлектролиту противоположно заряженного ПАВ (до точки минимума вязкости) получается система, напоминающая полимерное мыло. Часть зарядов полииона нейтрализована заряженными группами ионов ПАВ, тогда как длинноцепные гидрофобные радикалы ПАВ, стремясь избежать контакта с водой, образуют неполярные ядра. Эти ядра поддерживаются в воде свободными зарядами полиэлектролита – образуется мономолекулярная мицелла. Добавление органического растворителя приводит к разрушению гидрофобного ядра мицеллы, что сопровождается разворачиванием компактных клубков поликомплекса и увеличением их размеров.

Гидрофобизация комплексов полиэлектролит–ПАВ обусловливает их компактизацию и выделение в отдельную фазу. Так, добавление ПАВ к полиэлектролиту приводит к сильному снижению приведенной вязкости, что свидетельствует об уменьшении размера комплексных частиц. Однако, дальнейшее увеличение содержания ПАВ может привести к гомогенизации системы и возрастанию вязкости. Это зависит от баланса между энергиями электростатического и гидрофобного взаимодействий.

На глубину комплексообразования и стабильность ассоциатов полимер-ПАВ влияют такие факторы как длина цепи полимера, гибкость, конформация, микроструктура полимерных молекул, свойства среды (концентрации компонентов, степень их ионизации, температура, рН и ионная сила среды, состав растворителя). Огромное количество работ посвящено исследованию комплексов полимер-ПАВ и выяснению влияния перечисленных выше факторов на свойства образующихся ассоциатов.

Смешивание разбавленных водных растворов поликислот и полиоснований с противоположно заряженным ПАВ приводит к заметному изменению рН раствора и появлению опалесценции раствора вплоть до выпадения осадка. Такое поведение смесей полиэлектролитов с соответствующими детергентами авторы объясняют, по аналогии с образованием солевых комплексов между противоположно заряженными макромолекулами с образованием комплекса ПЭ-ПАВ, который сопровождается выделением ионов низкомолекулярной кислоты и щелочи:

СООН + ~ →-СОО - ~ + Н+        (1)

NH2 + ~ → ~ +NH2 + ОН-        (2)

Необходимо отметить, что реакция взаимодействия слабых поликислот и полиоснований с ПАВ являются уникальными, так как при комплексообразовании с ПАВ слабая поликислота вытесняет сильную поликислоту, а слабое полиоснование – сильное полиоснование. Равновесие аналогичных реакций (1) и (2) для низкомолекулярных модельных систем практически полностью сдвинуто влево. Отсюда можно заключить, что процесс электростатического взаимодействия ПЭ с ПАВ не происходил бы в заметной степени, если бы он не стабилизировался дополнительно гидрофобными взаимодействиями неполярных участков вступающих в реакцию связывания.