В большинстве плодов основной их окраски  являются также антоцианы. Широко распространены и флавоноловые гликозиды. В листьях главными являются  флавоноловые гликозиды, а антоцианов в них сравнительно мало. В семенах флавоноиды могут находиться как в свободном, так и в связанном состоянии. Например, это может относиться к флавонолу кверцетину. Функция флавоноидов в семенах неясна. Высказано предположение, что они могут быть ингибиторами прорастания [5].

VI. Роль флавоноидов в жизнедеятельности растительного организма.

    Биологическая роль флавоноидов в жизни растений изучена еще недостаточно.

    Некоторые авторы считают, что флавоноиды принимают участие:

    •  в окислительно-восстановительных  процессах растений;

    •  в выработке иммунитета;

    • в защите растений от неблагоприятных  воздействий ультрафиолетовых лучей  и низких температур. Предполагается, что благодаря способности поглощать  ультрафиолетовое излучение (330–350 нм) и часть видимых лучей (520–560 нм) флавоноиды  защищают растительные ткани от избыточной радиации. Это подтверждается локализацией флавоноидов  в эпидермальных (близких к поверхности) клетках растений.

    •  в процессе оплодотворения высших растений;

    •  обуславливают огромное разнообразие окрасок цветков и плодов, что  привлекает насекомых и тем самым  способствуют опылению;

    • некоторые флавоноиды защищают аскорбиновую кислоту от окисления (т.е. являются антиоксидантами).

• входя в состав экстрактивных веществ древесины, флавоноиды  способны придавать ей особую прочность и устойчивость к поражениям патогенными грибами [2].

VII. Влияние онтогенетических факторов и условий среды на накопление флавоноидов в растениях.

1. На накопление флавоноидов оказывают влияние возраст и фаза развития растения. В молодых растениях их больше; в старых растениях их количество уменьшается. Максимальное содержание флавоноидов наблюдается в цветках, листьях и травах в период бутонизации и цветения, а к фазе плодоношения содержание снижается; в плодах и семенах - в период молочной зрелости - полного созревания; в корнях - в период увядания надземной массы осенью.
2. На накопление флавоноидов влияет освещенность. Содержание флавоноидов в растениях увеличивается с ростом освещенности, а степень их гидроксилирования (число -ОН групп) - с увеличением высоты над уровнем моря.
3. На накопление флавоноидов влияет температура. Содержание антоцианов увеличивается при понижении температуры (покраснение листьев у щавеля), у других групп флавоноидов, наоборот, содержание увеличивается    при повышении температуры [2].

VIII. Сбор, сушка и хранение  ЛРС, содержащего флавоноиды.

    Сбор  сырья проводится в фазу наибольшего  накопления флавоноидов. Заготовку  надземных частей проводят в фазу бутонизации или начала цветения, подземных – в конце вегетации [2]. В фазу цветения собирают цветки василька синего, пижмы, бессмертника, траву сушеницы, горцев, пустырника. Особенностью сбора сушеницы является выдергивание растения с корнем. Пустырник собирают при цветении нижних цветков. В фазе полного цветения наступает "перезревание", чашечка твердеет и становится колючей, а сырье считается некачественным. Траву череды собирают в период бутонизации. После цветения образуются плоды - семянки с колючими остями. Сбор дикорастущего сырья производят вручную с использованием ножей, ножниц и серпов. Для сбора культивированных растений (цветки бессмертника, плоды боярышника) применяют малую механизацию [7].

    Сырье необходимо сушить вскоре после сбора, т.к. флавоноидные гликозиды под влиянием ферментов в присутствии влаги легко гидролизуются на сахар и агликон, а свободные агликоны могут окисляться.

    Сушить  сырье следует в тени или в  сушилках с искусственным и естественным обогревом. Плоды сушат при температуре 70-90°С, траву - 50-60°С; цветки - 40°С. Не допускается сушка на солнце. Медленная сушка, особенно на солнце, ведет к разрушению флавоноидов.

    Сырье необходимо оберегать от влаги и  прямых солнечных лучей. Сохранять  в плотно укупоренной таре, в хорошо проветриваемом помещении [2].

IX. Методы выделения.

    Для флавоноидов, как и для других веществ, не существует способа выделения, универсального для всех растительных материалов. В каждом конкретном случае прибегают к наиболее подходящему  методу или сочетанию методов, с учётом в основном свойств веществ и особенностей растительного сырья. Наиболее часто используются избирательная экстракция, осаждение с помощью солей тяжёлых металлов и хроматографические методы [5].

    Для выделения флавоноидов из растительного сырья в качестве экстрагента чаще всего используют метиловый или этиловый спирты или их смеси с водой.

    Полученное  спиртовое извлечение упаривают (упаривание проводят в вакууме при возможно низкой температуре (50-70º)), разбавляют горячей водой и удаляют липофильные вещества (жирные масла, смолы, хлорофилл) из водной фазы делительной воронки дихлорэтаном или четыреххлористым углеродом. После этой очистки  агликоны извлекают этиловым эфиром, монозиды (в основном) этилацетатом и биозиды, триозиды – н- бутанолом, насыщенным водой.

    Компоненты  каждой фракции разделяют, используя колоночную хроматографию, с применением в качестве сорбента полиамида, силикагеля или целлюлозы. Элюирование веществ с колонки (агликоны) проводят смесью хлороформа с метанолом или этанолом с возрастающей концентрацией спиртов или спиртоводными смесями (гликозиды), начиная с воды и увеличивая концентрацию спирта [6].

    Для отделения и очистки многих флавоноидов  иногда используют их способность образовывать нерастворимые в воде и спирте соли при взаимодействии с ионами тяжелых металлов, а также влияние рН на образование таких осадков. Флавоноиды, содержащие свободные орто-гидроксильные группы в кольце В, при обработке их спиртовых растворов солями среднего или основного ацетата свинца образуют осадки, окрашенные в ярко-желтый и красный цвета. Осадки затем центрифугируют и после суспендирования в разбавленных спиртах разлагают с помощью сероводорода. Далее флавоноиды отделяют либо путем перекристаллизации, либо хроматографическими методами [5].

    Для идентификации флавоноидов используют их физико-химические свойства: определение температуры плавления, определение удельного вращения гликозидов и сравнение их УФ-, ИК-, ПМР- спектров со спектрами известных образцов [6]. 

    

X. Методы анализа.

Качественное  определение.

    Для обнаружения флавоноидов в ЛРС используют химические реакции и хроматографию. Химические реакции подразделяются на цветные и реакции осаждения.

1.Цветные  реакции.

    1.Цианидиновая  проба.

    Общей реакцией на флавоноидные соединения является цианидиновая проба, проводимая с помощью концентрированной соляной кислоты и металлического магния. Действие водорода в момент выделения приводит к восстановлению карбонильной группы и образованию ненасыщенного пиранового цикла, который под действием соляной кислоты превращается в оксониевое соединение, имеющее окраску от оранжевой (флавоны) до красно-фиолетовой (флаваноны, флавонолы, флаванонолы). 

    Изменение условий восстановления путем замены магния на цинк приводит к изменению  окраски. При использовании цинка  положительную реакцию дают флавонолы и флавонол-3-гликозиды, а флаваноны не обнаруживают ее.

    Цианидиновую  реакцию не обнаруживают халконы, ауроны, но при добавлении концентрированной  соляной кислоты (без магния) образуют красное окрашивание за счет образования оксониевых солей [6].

    Для постановки реакции 1 г порошка сырья заливают 10 мл 95% этанола, нагревают на водяной бане до кипения и настаивают 3-4 ч. Спиртовое извлечение фильтруют, упаривают до объема 2 мл, делят пополам и разливают в 2 пробирки; в каждую пробирку прибавляют по 3 капли концентрированной хлористоводородной кислоты. В 1-ю пробирку добавляют 0,03-0,05 г цинковой пыли и нагревают на водяной бане до кипения. Жидкость окрашивается в красный цвет. Во 2-й пробирке окрашивание отсутствует [7].

      
 
 

   ЦИАНИДИНХЛОРИД 

    2. Борно-лимонная реакция (реакция Вильсона- Таубека).

     5-оксифлавоны  и 5-оксифлавонолы, взаимодействуя  с борной кислотой в присутствии лимонной (реактив Вильсона), образуют желтую окраску с красноватой флюоресценцией в УФ-свете. При замене лимонной кислоты на щавелевую (реактив Таубека) в УФ-свете отмечается зеленая или желтая флюоресценция. 
 
 
 
 
 
 
 
 

    3. Реакция с треххлористой  сурьмой.

    5-оксифлавоны  и 5-оксифлавонолы, взаимодействуя  с треххлористой сурьмой, образуют комплексные соединения, окрашенные в желтый или желто-оранжевый цвет - флавоны, в красный или красно-фиолетовый - халконы.

     4.  Характерной реакцией на флавоноиды является их взаимодействие со щелочами с образованием желтой окраски. Халконы и ауроны дают со щелочами красное или ярко-желтое окрашивание, антоцианидины-синее окрашивание.

    5. Флавоноиды со свободной 7-оксигруппой легко образуют азо-красители с диазотированной сулъфаниловой кислотой и другими производными ароматических аминов [6]. Появление тотчас же оранжево-красной окраски в видимом свете указывает на присутствие 7-оксифлавонов, 7-оксифлавонолов, 7-оксиизофлавонов. Появление окраски через 1-2 минуты, подтверждает наличие 7-оксифлавононов [5].

    6. Ряд флавоноидов дает окрашенные комплексы с ионами алюминия, циркония, окрашенные, как правило, в УФ-свете в ярко-желтый цвет, что используется при их хроматографическом обнаружении.

    7.   Как все фенольные соединения, флавоноиды взаимодействуют с хлоридом окисного железа с образованием различно окрашенных комплексов (от зеленого до коричневого). Реакция мало специфична [6].

2. Реакции осаждения.

    Все флавоноиды с основным ацетатом свинца образуют осадки, окрашенные в ярко-жёлтый или красный цвет.

    Средним ацетатом свинца осаждаются лишь флавоноид, содержащие свободные орто-гидроксильные  группы в 3’4’-положениях кольца В [2].

3. Хроматография.

    Для обнаружения флавоноидов в растительном материале широко используется бумажная и тонкослойная хроматография. Флавоноиды идеально подходят для хроматографического  анализа благодаря их различной  растворимости, сорбционной способности, а также характерным окраскам самих веществ в видимом и фильтрованном ультрафиолетовом свете до и после проявления различными хромогенными реагентами. Обнаружение флавоноидов на хроматограммах проводят:

    • по окраске пятен в видимом  свете (антоцианы);

    • по характеру свечения в УФ-свете: флавоны, флавонол-3-О-гликозиды, флаваноны  и халконы обнаруживаются в виде темно-коричневых пятен, флавонолы  и их 7-О-гликозиды – в виде желтых или желто-зеленых;

    • по характеру свечения в УФ-свете  после проявления 5%-ным спиртовым раствором хлорида алюминия и последующего прогревания хроматограммы при 105°С в течение 2-3 мин, наблюдают пятна флавоноидов с интенсивной желтой и желто-зеленой флуоресценцией [2].

Количественное  определение.

       Для количественного определения флавоноидов в растительном сырье наибольшее распространение получили физико-химические методы, прежде всего фотоколориметрия и спектрофотометрия.

    1.  Фотоколориметрический метод основан:

    •  на цветных реакциях комплексообразования с солями различных металлов (алюминия, циркония, хрома, сурьмы);

    • на реакции с лимонно-борным реактивом;

    • на реакции восстановления атомарным  водородом в кислой

    среде в присутствии металлического магния или цинка.

    2.  Спектрофотометрический метод, основанный на способности флавоноидов поглощать свет в УФ-области спектра.

    3.  Хромато-спектрофотометрический метод - более совершенный метод количественного определения флавоноидов, используется в сочетании с хроматографией, что позволяет произвести очистку и разделение суммы веществ на отдельные компоненты.