Рис №4 «Зеараленон»
Исследования показали, что зеараленон
способен накапливаться в печени, мышечной
ткани и птичьих яйцах. Хотя прямых доказательств
опасности для человека нет, есть мнение,
что этот микотоксин повышает вероятность
опухолей молочной железы. Токсический
эффект у животных проявляется в увеличении
молочных желез, отечности половых органов,
у самок происходят выкидыши и развивается
бесплодие. Свиньи особенно чувствительны
к зеараленону.
Не разрушается при измельчении, термической
обработке и ферментации зерна. Иногда
он встречается в пищевых продуктах вместе
с трихотеценовыми токсинами.
2.5 Патулин и некоторые другие
микотоксины
Микотоксины, продуцируемые микроскопическими
грибами рода Penicillium, распространены повсеместно
и представляют реальную опасность для
здоровья человека. Патулин особо опасный
микотоксин, обладающий канцерогенными
и мутагенными свойствами.
Рис №5 «Патулин»
Основными продуцентами патулина являются
микроскопические грибы Penicillium patulum и Penicillium
expansu. Но и другие виды этого рода микроскопических
грибов, а также Byssochlamysfulva и В. nivea способны
синтезировать патулин. Максимальное
токсинообразование отмечается при температуре
21-30°С.
Чаще всего этот микотоксин встречается
в яблоках, но его могут содержать и другие
фрукты: груши, вишни, абрикосы, персики,
а так же овощи, злаки и силос. Патулин
часто встречается в гниющих яблоках,
поэтому перед употреблением яблок в пищу
и при изготовлении сока рекомендуется
срезать подгнившие участки фруктов и
сантиметровый слой здоровой ткани вокруг
них.
Биологическое действие патулина проявляется
как в виде острых токсикозов, так и в виде
ярко выраженных канцерогенных и мутагенных
эффектов. Предполагают, что патулин блокирует
синтез ДНК, РНК и белков.
При использовании дозы, значительно
превышающей природную концентрацию этого
микотоксина, наблюдались серьезные поражения
нервной системы у скота и овец, которых
кормили загрязненным силосом, а так же
повреждения пищеварительного тракта.
Среди микотоксинов, продуцируемых микроскопическими
грибами рода Penicillium и представляющих
серьезную опасность для здоровья человека,
необходимо выделить лютеоскирин, циклохлоротин,
цитреовиридин и цитринин.
- Лютеоскирин (продуцент Penicillium islandicum) - желтое кристаллическое вещество, выделен из долго хранившегося риса, а также пшеницы, сои, арахиса, бобовых и некоторых видов перца.
- Циклохлоротин (продуцент Penicillium islandicum) - белое кристаллическое вещество, циклический пептид, содержащий хлор. Биохимические механизмы токсического действия направлены на нарушение углеводного и белкового обмена и связаны с ингибированием целого ряда ферментов. Кроме этого, токсическое действие циклохлоротина проявляется в нарушении регуляции проницаемости биологических мембран и процессов окислительного фосфорилирования.
- Цитреовиридин (продуцент Penicillium citreo-viride) - желтое кристаллическое вещество, выделен из пожелтевшего риса. Обладает нейротоксическими
свойствами.
- Цитринин (продуцент Penicillium citrinum) - кристаллическое вещество желтого цвета, выделен из пожелтевшего риса. Цитринин часто обнаруживается в различных зерновых культурах: пшенице, ячмене, овсе, ржи, а также в кукурузе и арахисе. Кроме этого, незначительные количества цитринина были найдены в хлебобулочных изделиях, мясных продуктах и фруктах. Обладает выраженными нефротоксическими свойствами.
3. Факторы, влияющие
на образование микотоксинов
Основными факторами, влияющими
на растения и, следовательно, на продукцию
микотоксинов, являются наличие следующих
факторов:
- Влажность субстрата является принципиальным фактором, который следует учитывать при предупреждении контаминации, и ее контроль становится основным, например, при производстве кормов.
- При температуре около 25℃ Aspergillus flavus активно производит афлатоксины. При 10℃ образование токсинов никогда не отмечалось. Fusarium tricinctum может продуцировать Т-2 токсин при температурах между 1 и
4℃, максимально - 15℃. Образование охратоксина Aspergillus ochraceus идет при 20-30℃, но никак не ниже 12℃. Тот же микотоксин продуцирует Penicillium viridicatum в температурном диапазоне от 4 до
31℃.
Важный фактор, который следует
принять во внимание,-тип субстрата. Растительный
субстрат усиливает образование микотоксинов
больше, чем животный и животного происхождения.
Действие микотоксина усиливается
в присутствии крахмала, а на образование
афлатаксинов влияет присутствие цинка.
Более часто контаминируемые продукты
- кукуруза, арахис и хлопок. Соки и фрукты
явлются главными носителями патулина
и зерновых охратоксина.
Микотоксины грибов Aspergillus и
Penicillium (афлатоксин, охратоксин и др.) образуются
большей частью во время хранения пищевого
сырья. В противоположность этому синтез
афлатоксина может иметь место в тропических
и субтропических условиях в процессе
вегетации растений.
Чтобы предотвратить контаминацию
кормов микотоксинами, необходимо предотвратить
рост плесени. Следовательно, необходимо
иметь работающую стратегию (эффективный
план мероприятий), который бы был разработан
на основе законов, которые регулируют
жизнь грибов плесени. Им необходимы вода,
кислород (как минимум 1-2 %), время и благоприятная
температура (в зависимости от вида гриба;
повышенные температуры стимулируют грибы
видов Aspergillus, пониженные Fusarium. Одной из
общих особенностей плесневых грибов
на слабогидратированных кормах является
их способность к образованию и распространению
спор.
Принципиальными факторами,
оказывающими влияние на образование
микотоксинов, являются:
Вид гриба, который определяет
категорию продуцируемых микотоксинов.
Начальный уровень контаминации,
который влияет на количество образованных
микотоксинов (чем больше грибов, тем больше
потенциал образования микотоксинов)
- Внешние факторы, например,
условия окружающей среды. Эти факторы
определяют размножение и рост грибков,
а, следовательно, и образование микотоксинов
- Химические, физико-химические
и физические факторы, такие как влажность,
наличие свободной воды, температура,
тип субстрата, газовый состав (атмосфера) и механические повреждения
- Биологические факторы, такие
как насекомые, или как фактор переноса
спор грибов или как фактор, обуславливающий
механические повреждения вплоть до кариопсиса, облегчающие проникновение гриба внутрь; микрофлора и конкуренция между штаммами; стресс растений (засуха); прочность (устойчивость) оболочки, или генетическая сила, или целостность кариопсиса.
.
.
4. Методы анализа
микотоксинов
Термин микотоксины охватывает
широкую группу соединений весьма отличающихся
по своему химическому строению а, следовательно,
по оказываемому токсическому действию.
Необходимость четкого определения вида
и концентрации микотоксина, содержащегося
в том или ином корме обуславливается
также возможной контаминацией их несколькими
микотоксинами одновременно, что не позволяет
четко поставить диагноз на микотоксикоз,
основываясь только на клинической картине.
Исследование проб кормов, проводимое
с 2003 года подтвердило, что, как правило
(85-90 % случаев), в одном образце присутствует
сразу несколько видов микотоксинов. Особенно
это касается токсинов, продуцируемых
грибами рода Fusarium. Можно сделать вывод,
что есть потребность в аналитических
методах исследования гарантирующих,
что корма и продукты питания не содержат
микотоксины выше допустимых пределов.
В настоящее время существует
ряд приборных методов количественного
определения микотоксинов в кормах и продуктах
питания. Наиболее распространенными
из них в настоящее время являются методики
с использованием тонкослойной хроматографии
(ТСХ, TLC), высокоэффективной жидкостной
хроматографии (ВЭЖХ, HPLC), газовой хроматографии
(ГХ, GC), масс-спектрометрии (МС, MS) и их сочетаний.
Тонкослойная хроматография
является хроматографической методикой,
применяемой для разделения, оценки чистоты
и идентификации органических соединений.
Она основана на применении пластин с
нанесенной неподвижной фазой и подвижной
фазы (растворитель). Идентификация анализируемого
вещества проводится при одновременном
внесении на пластину экстракта образца
и стандартных растворов с известной концентрацией.
Различные соединения в смеси продвигаются
по пластине с различной скоростью вследствие
различия в закономерностях их разделения
между мобильной жидкой и неподвижной
фазами. На этом принципе основано разделение
веществ в смеси экстракта. Флуоресцирующие
вещества выявляют в УФ-свете, все остальные
- с помощью специфических реагентов. Дальнейшее
развитие метод получил под названием
высокоэффективной тонкослойной хроматографии
(ВЭТСХ, HPTLC). Уменьшение толщины слоя неподвижной
фазы (до 100 мкм) и величины частиц (до 5
мкм), привело к лучшему разделению веществ
за более короткий период времени.
Методы ТСХ доступны почти для
всех микотоксинов. Обнаружение и специфическая
идентификация разработаны для каждого
отдельного микотоксина, при этом используют
молекулярные свойства или реакции трансформации
веществ.
Главные недостатки тонкослойной
хроматографии:
- малая производительность;
- большинство образцов нуждается
в этапах экстракции и очистки для удаления
потенциальных помех и матричных соединений
перед анализом;
- концентрация анализируемого
вещества должна быть в диапазоне 0,01-0,1
%;
- использование токсичных и
летучих веществ в качестве растворителя.
Методы высокоэффективной жидкостной
хроматографии (ВЭЖХ) в области исследования
микотоксинов главным образом используются
для заключительного отделения матричных
соединений и обнаружения интересующего
анализируемого вещества. В настоящее
время методы ВЭЖХ широко распространены
из-за их превосходящих характеристик
и надежности по сравнению с тонкослойной
хроматографией. Методы ВЭЖХ были разработаны
для большинства основных микотоксинов
в зерновых культурах и другой сельскохозяйственной
продукции. Большинство методов надежны
и стабильны.
Метод ВЭЖХ основан на разделении
анализируемого экстракта в неподвижной
фазе хроматографической колонки (для
анализа микотоксинов чаще используются
колонки С8 и С18) и дальнейшей их идентификации
и количественном определении с помощью
специальных детекторов. Наиболее распространенными
детекторами для анализа микотоксинов
в настоящее время являются ультрафиолетовый
и флуоресцентный. Пределы чувствительности
методов ВЭЖХ с применением данных детекторов
могут доходить до 1 мкг/кг образца. В литературе
сообщалось о разработке методов ВЭЖХ
для одновременного анализа нескольких
микотоксинов. Особенно успешно таким
образом анализируются трихотеценовые
микотоксины, в частности трихотецены.
Другие методы по исследованию
микотоксинов, использующие иммунологический
подход, о которых сообщается в литературе,
включают оптические и акустические биосенсоры,
капиллярный электрофорез.
Мембранный тест позволяет
за короткий период времени (около 10-15
мин) дать ответ на вопрос: присутствуют
ли в испытуемом образце микотоксины выше
уровня предела чувствительности данного
теста. То есть фактически это качественное
определение наличия/отсутствия микотоксинов
в пробе. Метод требует экстракции, фильтрации,
очистки (через колонку) и разведения образца.
Далее раствор наносится на мембрану,
сенсибилизированную моноклональными
антителами, куда также добавляется ферментный
конъюгат микотоксина. Если концентрация
микотоксинов в образце превышает предел
чувствительности теста, все антитела
на поверхности связываются с ними и весь
добавленный конъюгат удаляется на этапе
отмывки. При добавлении бесцветного субстрата
конъюгат на поверхности мембраны катализирует
цветную реакцию, в результате которой
на месте связывания конъюгата образуется
цветное пятно. Окрашивание аналитической
зоны мембраны говорит об отсутствии микотоксинов
в образце.
Иммуноферментный анализ обычно
используется для мониторинга наличия
микотоксинов выше определенного уровня
(или их отсутствия) в испытуемом образце.
В настоящее время доступен ряд качественных,
полуколичественных и количественных
методов. Основываясь на результатах ИФА
подозрительные образцы должны быть перепроверены
классическими методами. Доступны различные
варианты ИФА для анализа микотоксинов
(например, мембранные тесты, микротитровальные
планшеты и пробирочные методы). Как правило,
метод ИФА основан на конкурентом анализе,
который использует или связанные с ферментным
конъюгатом микотоксинов, или антитела
против определенного анализируемого
токсина. Типичная последовательность
реакций с использованием готовых реактивов
в формате микротитровального планшета
следующие:
- ферментный конъюгат добавляется к экстракту испытуемого образца;
- смесь добавляется к соответствующим
антителам, нанесенным на поверхность
лунок планшета (например, микротитровальный планшет, сенсибилизированный антителами);
- количество соединенного с
токсином конъюгата, связываемое иммобилизированными антителами, зависит от количества токсина в образце; чем выше количество токсина в образце, тем ниже будет количество ферментного конъюгата, присоединившегося к антителам, нанесенным на поверхность лунок планшета и наоборот;
- ферментативная активность
связанного с поверхностными антителами конъюгата определяется добавлением соответствующего субстрата, что приводит к образованию окрашенных продуктов, концентрация которых обратно пропорциональна концентрации токсина в испытуемом образце.
Можно провести анализ содержания
микотоксинов в кормах с использованием
иммуноферментного метода. Для исследования
применим готовые тест-системы производства
компании R-Biopharm, Германия. Этой компанией
выпускается ряд наборов для количественного
определения микотоксинов: афлатоксины
В, G, М, зеараленон, охратоксин А, Т-2 токсин,
дезоксиниваленол, фумонизин В1, цитринина.
Следует отметить, что практически для
всех перечисленных микотоксинов существуют
варианты тест-систем для определения
особо малых концентраций этих токсичных
соединений с пределом чувствительности
на уровне хроматографических методик
(RIDASCREEN® Mycotoxins) (время инкубации 1-2 часа)
и экспресс-методы, позволяющие определять
практически такие же концентрации в течение
15-30 минут (RIDASCREEN® FAST Mycotoxins). Все методики
прошли утверждение и могут использоваться
в лабораториях, входящих в структуру
Министерства сельского хозяйства и продовольствия.
Организация анализа микотоксинов
в кормах и пищевых продуктах иммуноферментным
методом возможна минимальными средствами
и в самые короткие сроки. Простота эксплуатации
и незначительная стоимость необходимого
оборудования выгодно отличают иммуноферментный
метод от классических методов анализа
и делают его особенно привлекательным
для лабораторий с ограниченными финансовыми
возможностями.
Необходимо отметить, что при
практически равных показателях пределов
обнаружения методы иммуноферментного
анализа являются более производительными
и позволяют проводить избирательное
исследование только подозрительных по
ИФА образцов инструментальными методами.
Например, методом ИФА один лаборант может
провести исследование 10-100 образцов за
одну рабочую смену, в то время как при
использовании ВЭЖХ - только 1-10 проб. При
этом на проведение иммуноферментного
анализа затрачивается от 15 минут до 3
часов (пробоподготовка до 1 часа), а методом
ВЭЖХ - 2-4 часа при 1-3-дневной пробоподготовке.