Влияние вакуумного ультрафиолета на гемоглобин

 
 
 
 

ОГЛАВЛЕНИЕ:

ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………………….3

Глава 1. ОБЗОР  ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………5

      1.1.Структура  молекулы гемоглобина……………………………………5

      1.2.Спектральные  характеристики гемоглобина………………………...8

1.3.Биологическое  действие вакуумного ультрафиолетового излучения…………………………………………………………………………..9

1.4.Действие вакуумного ультрафиолетового излучении на аминокислоты и белковые системы………………………………………………..10

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ…………………………………..14

2.1. ЦЕЛЬ И  ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ……………………….........14

2.2. ОБЪЕКТ  И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ………………………..14

2.2.1.Объект  исследования……………………………………………...14

2.2.2.Методика  приготовления тонких пленок  гемоглобина…………14

2.2.3.Методика  получения тонких пленок гемоглобина……………....15

2.2.4.Регистрация  спектров поглощения белковых образцов в видимой области спектра…………………………………………………………..15

2.3.ПОЛУЧЕННЫЕ  РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ…………..16

ЗАКЛЮЧЕНИЕ И  ВЫВОДЫ…………………………………………………...19

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ……………………………20 
 
 
 
 
 
 
 
 

ВВЕДЕНИЕ

      Исследование  фотохимических процессов, происходящих в белках под влиянием вакуумного ультрафиолетового (ВУФ) излучения (λ<200 нм), имеют важное значение для выяснения физико-химических основ его биологического действия.

      Основными процессами дезактивации высоковозбужденных состояний молекул после поглощения квантов ВУФ – излучения является люминесценция, фото-диссоциация, фотоионизация. Возможны также фотохимические реакции, связанные с деструкцией или синтезом биомолекул. Знание их эффективности, определяемой величиной квантового выхода, может быть использовано для выяснения механизмов фотопревращений биомолекул при ВУФ – облучении. Большинство работ, посвященных биологическому действию вакуумного ультрафиолетового излучения на молекулярном уровне, выполнено с использованием в качестве объектов исследования нуклеиновых кислот и их компонентов (Д.А. Сухов и др., 1976; Н.М. Цыганенко и др., 1987; Е.В. Хорошилова и др., 1991; Н.Я. Додонова и др., 1994). Особенностями взаимодействия ВУФ – излучения с белковыми системами уделено гораздо меньше внимания со стороны исследователей. В литературе практически не обсуждался вопрос о взаимосвязи дозозависимых структурных перестроек молекул белка с изменением их функциональной активности после ВУФ – облучения, не определено соотношение вкладов тех или иных фотохимических процессов в эффектах ВУФ – модификации белковых макромолекул, поэтому анализ экспериментальных данных, касающихся фотохимических изменений белковых молекул, индуцированных ВУФ – излучением, позволит наметить некоторые модельные подходы к установлению возможных путей эволюции структуры этих биологически важных молекул.

      Фотохимические  процессы, происходящие в белках под  действием ВУФ – света в  спектральной области 200 – 400 нм, изучались  многими авторами (С.В. Конев, И.Д. Волотовский, 1979; Д.И. Рощупкин, 1979; И.И. Сапежинский, 1981; Ю.А. Владимиров, А.Я. Потапенко, 1989; В.Г. Артюхов, 1995). В вакуумной УФ области спектра с λ<200 нм эти процессы практически не исследованы. Действие УФ – и ВУФ – излучения  на белковые системы может различаться первичными фотофизическими процессами, что может привести к образованию неодинаковых конечных фотопродуктов и к инактивации белковых молекул (R. Settlow, 1960).

      Обладая значительной энергией квантов (до 120 эВ), ВУФ – излучение способно вызывать ионизацию биологических молекул, поэтому расширение спектрального диапазона исследований в области вакуумного ультрафиолета позволит получить информацию о механизмах биологического действия этого ионизирующего излучения при его взаимодействии с белковыми системами. Гемоглобин как объект характеризуется значительным содержанием среди всех белковых компонентов крови, известной структурной организацией и важностью функций, преимущественно транспортной.

      Изучение  биологических эффектов ВУФ –  излучения затрудняется тем обстоятельством, что его кванты поглощаются кислородом воздуха, а также кварцем и стеклом. Поэтому для исследований в этой области спектра необходимо применять высоковакуумные спектральные приборы, нестандартные источники и приемники излучения, оптические материалы, прозрачные для вакуумного ультрафиолета.

      Кроме того, поскольку глубина проникновения  ВУФ – излучения в вещество невелика, для исследований на молекулярном уровне применяются водные растворы и пленки толщиной порядка 0,1 мкм.

      Целью настоящей работы является изучение методик приготовления тонких пленок белка, их ВУФ – облучение, а также изучение оптических характеристик молекул гемоглобина человека до и после воздействия на них ВУФ – излучения (118 – 134 нм) в дозе 1,8 кДж/м². 
 
 
 
 

1. Обзор литературы

     1.1 Структура молекулы гемоглобина

     Гемоглобин  – основной компонент эритроцитов, в которых его содержание составляет более 95% всех белковых компонентов или около 280 млн. молекул на клетку, что составляет около 30% её массы.

     Гемоглобин  – сложный белок, относящийся к классу гемопротеидов, что обусловлено наличие в его структуре простетической группы – гемма, и белковой части глобина. На неорганическую часть приходится 4 %, а на апобелок – 96% от общей массы молекулы гемопротеида.

     Группировка гемма играет важную роль практически для всех типов живых клеток и представляет собой сложную компланарную циклическую систему, состоящую из центрального атома, образующего координационные связи со структурой, образованной четырьмя остатками пиррола, соединенными метиловыми мостиками (=СН-), и носящей название парфирина (циклического тетрапиррола). В гемоглобине в роли центрального атома выступает атом железа, который может находиться в закисном (гем) или окисном (гемин) состояниях и комплексируется с протопорфирином IX (протопорфирин, у которого в положениях 1,3,5,8 находятся метильные, а в положениях 2, 4 – винильные группы, а в положениях 6, 7 – остатки пропионовой кислоты, путем замещения двух атомов водорода центральных азотов протопорфирина) (рис. 1). Такой комплекс является четырёхкоординированным и имеет почти плоскую структуру. Две другие координационные вакансии располагаются в направления, перпендикулярных плоскости гемма. Координационной ненасыщенностью обусловлена способность железопорфиринов образовывать комплексы с рядом молекул и ионов, прежде всего, что особенно важно для организма, с молекулами кислорода.

     Однако  Fe² - гем, не связанный с глобином, по крайней мере, в водных растворах, не способен обратимо присоединять кислород и вместо этого окисляется до Fe - гемина, который не может далее взаимодействовать с кислородом. Исходя из этого, становится понятна та роль, которую играет белковая часть молекулы в проявлении гемопротеидом своих функциональных свойств.

     Структурные и функциональные параметры молекулы гемоглобина во многом зависят от состояния атома железа. В дезоксигемоглобине атом железа выходит на 0,8 А из плоскости порфиринового кольца, а в метгемоглобине на 0,3 А. В окси-, карбокси- и циангемоглобине он лежит в плоскости кольца.

     Гемоглобин  представляет собой гетерогенный тетрамер, состоящий из двух попарно идентичных α- и β- цепей, что позволяет относить данный белок к группе олигомеров. α- Цепь гемоглобина содержит 141 аминокислотный остаток, β- цепь – 146 остатков. Таким образом, в составе гембелка всего 574 аминокислотных остатка. Видовые различия гемоглобинов связаны с различием некоторых аминокислот, но не затрагивают 15 ключевых (инвариантных) остатков. Глобиновые цепи образуют 8 спиральных сегментов Полинга – Кори разной длины, обозначаемых буквами латинского алфавита от А до Н начиная с N-го конца, разделённых неспиральными участками.

     В целом структура гемоглобина  достаточно полно исследована. Это  позволяет соотносить изменения регистрируемых характеристик гемопротеида с определенными конформационными перестройками его макромолекулы. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Строение  гемовой части гемоглобина 
 

     

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Рис. 1 

1.2. Спектральные характеристики  гемоглобина

     Оптическая  спектрофотометрия - один из самых эффективных методов изучения растворов гемопротеидов. Он является основным при изучении различного рода превращений биополимеров и позволяет исследовать способность молекул поглощать и трансформировать энергию света, что лежит в основе многих, прежде всего фотобиологических процессов.

     При анализе структурных и функциональных свойств макромолекул особенно полезно  использование методов, в основе которых лежит регистрация их электронных спектров поглощения, с помощью которых можно проследить изменения, происходящие в молекуле или её составных частях при действии её физико-химических факторов.

     Как белок, гемоглобин имеет две полосы поглощения в УФ-области спектра  с максимумами при 220 и 275 нм. Коротковолновая  полоса поглощения белка, природа которой дискутируется, обладает высокой интенсивностью и обусловлена, вероятно, наличием в его структуре пептидных связей. Длинноволновая полоса есть результат совокупного поглощения энергии квантов света ароматическими аминокислотами (триптофан, тирозин, фенилаланин), а также цистеином. В зависимости от источника получения гембелка и от конформационого состояния глобина положение и интенсивность указанных полос поглощения могут в значительной степени изменяться.

     За  поглощение света в видимой области  спектра ответственна порфириновая часть макромолекулы. Сильное влияние на полосы поглощения оказывают спиновое состояние системы и наличие лигандов с различным лигандным полем.

     Полоса  Соре отражает переходы типа π-π*- переходов порфиринового кольца и частично типа переноса заряда. Низкоспиновые полосы 542 и 546 нм иногда относят к синглет-триплетным переходам. Кроме того, в спектре поглощения оксигемоглобина присутствует полоса с λmax=342 нм, обусловленная особенностями железопофирина.

      Порфирин  является плоской сопряженной системой, относящейся к группе симметрии D4h, для которой в соответствии с правилами отбора разрешены переходы в возбужденные состояния eu, расщепленные на два уровня: b2u и b3u. В этом случае полосы в видимой части спектра принадлежат замкнутой оболочке порфирина.

      Простетическая  группа и соединенные с ней  группы глобина представляет собой уже структуру с симметрией типа октаэдра. Введение атома металла несколько изменяет основное состояние системы, которое становится для низкоспинового комплекса еg, а для высокоспинового – А+g.  При изменении спиновости гемопротеидов меняется положение всех трех основных полос поглощения в видимой области спектра, что может наблюдаться под влиянием физических и химических агентов. 
 

1.3 Биологическое действие  вакуумного ультрафиолетового излучения 

      Изучение  биологических эффектов после воздействия  ВУФ – света на биосистемы сопряжено  с учетом особенностей его действия на макромолекулы. Во-первых, обладая энергией порядка 6 – 120 эВ, кванты этого вида излучения способны вызвать фотодиссоциацию и фотоионизацию биомолекул. Во-вторых, из-за поглощения ВУФ-излучения кислородом воздуха и растворителем, в качестве которого в большинстве биосистем выступает вода, указанный вид излучения обладает малой проникающей способностью, поэтому для проведения исследований на молекулярном уровне необходимо использовать тонкие слои веществ порядка 10^-7 м.

      В ВУФ-области спектра основными  процессами дезактивации высоковозбужденных состояний молекул являются люминесценция, фотодиссоциация, фотоионизация. Знание эффективности этих процессов может быть использовано для выяснения механизмов фотопревращений биомолекул при ВУФ-облучении. Объектами исследования могут также служить тонкие пленки и водные растворы нуклеиновых кислот с белками, АТФ, споры бактерий, штаммы дрожжей и другие биообъекты, пригодные для изучения действия ВУФ-излучения на молекулярном и клеточном уровнях.

     Известно, что ВУФ-излучение с энергиями  квантов 5 – 10 эВ (120 – 190 нм) вызывает фотолиз  воды с образованием радикалов H·, OH· и eaq,  как это происходит при лазерном УФ-фотолизе и γ -радиолизе. При достаточно малых концентрациях растворенных веществ (10  - 10   М/л) их поглощением в ВУФ-области спектра можно пренебречь по сравнению с водой, и фоторазрушение молекул происходит по косвенному механизму через ВУФ-фотолиз так же, как и в случае действия ионизирующего, например, γ-излучения. На однозначность косвенного механизма действия ВУФ-излучения в водных растворах биомолекул указывают данные по защите тимина от фотодеструкции при добавлении в облучаемую среду акцепторов радикалов воды: метанол, трет-бутанол, CdSO4.  причем эффективность фотолиза уменьшается в ряду Тимин – тимидин - тимидинмонофосфат, что указывает на уменьшение вероятности атаки азотистого основания радикалами воды при включении в состав молекулы рибозофосфатных групп (как и для γ-излучения). Установлено, что фоторазложение молекул тимина с разрывом двойной связи тотального гистона более эффективно в водном растворе, чем в твердых образцах, что также подтверждает косвенный механизм действия вакуумного ультрафиолета через ВУФ-фотолиз воды. Таким образом, ВУФ-излучение действует на растворы так же, как и ионизирующее.