Вирусы огурца

   Электронно-микроскопический метод.

   Т.к. ВОМ имеет нестойкие вирионы, то для приготовления препаратов вируса необходимо применять различные дополнительные приемы, способствующие стабилизации вирусных частиц. Для ВОМ необходимо использовать только негативное контрастирование. Может быть использована следующая методика: кусочки листьев фиксируются в 5-10%  растворе формалина 2-3ч., после чего промываются в дистиллированной воде. Затем свежесрезанный край листа погружается в каплю 2%-ной фосфорновольфрамовой кислоты на 2-3сек.

   Большую роль в приготовлении качественных препаратов вируса играет очистка препаратов. Инфицированные листья измельчаются в равном объеме 0.5М цитрата натрия, рН 6.5, содержащего 0.5% тиогликолевой кислоты. Однородная смесь смешивается с одним объемом хлороформа и центрифугируется при 12000g в течение 10 минут. Вирус осаждается из водной фазы путем добавления полиэтиленгликоля (молекулярная масса 8000), аккуратно размешивается в течение 30-45 минут при 0-4⁰С и центрифугируется при 7000g в течение 20 мин.. Осадок снова растворяется в 50мМ цитрате натрия рН 7.0, содержащем 2% Тритона X-100, и размешивается в течение 30 мин. перед центрифугированием при 19000g в течение 15 мин. Дополнительная очистка достигается использованием циклов дифференциального центрифугирования и/или центрифугирования в 2-25% растворе сахарозы. Очищенные препараты вирусных частиц растворяются в 50мМ цитрате натрия, рН 7.0, или в 50мМ цитрате натрия с 5мМ боратом натрия, рН 9.2. Для новых штаммов, которые не могут быть очищены этим методом, используется альтернативный метод с применением фосфатного буфера для экстракции, избегая применения органических растворителей. Большинство штаммов, однако, агрегируют в фосфатных буферах.

   Недостатком данного метода диагностики является то, что вирусы по размеру и внешнему виду сходны с рибосомами, что делает сложным определение вируса в клеточных препаратах. Впрочем, этот недостаток преодолим, т.к. рибосому могут быть разложены без последствий для вирусных частиц. 

   Метод включений.

   Вирусные  частицы содержатся практически  во всех тканях зараженного растения. В клетке они разбросаны по всей цитоплазме, могут обнаруживаться также в ядре и вакуолях, но отсутствуют в митохондриях, хлоропластах и плазмодесмах. Агрегаты частиц, окруженные мембраной, присутствуют в ситовидных элементах флоэмы. Частицы также могут агрегировать в прозрачные структуры, находящиеся в вакуолях, где они могут быть обнаружены световой микроскопией. В поздней стадии инфекции в цитоплазме могут быть обнаружены трубковидные структуры, состоящие из цистерн диктиосом и содержащие частицы, похожие на вирусные. Небольшие мембранные впячивания иногда связаны с мембраной тонопласта.

   Серологическая  диагностика.

   Вирус малоиммуногеничен. Наиболее часто  используется ЭЛИЗА-тест в «сэндвич»-варианте, т.к. данный вариант показывает наибольшую штаммовую специфичность. В качестве фермента-маркера используется либо щелочная фосфатаза, либо пероксидаза хрена (более чувствительна). Одним из вариантов проведения теста является следующий: очищенный препарат вируса вводят кроликам в область шейных лимфоузлов подкожно в несколько точек, вводя 0.3-0.5 мг вируса с равным объемом адьюванта Фрейнда дважды с интервалом 30-40 сут. Кровь берется через 7-11 сут. после последней инъекции. Титр сыворотки, полученной таким образом, составляет 1:1024. Сыворотка реагирует с очищенными препаратами ВОМ и соком зараженного растения, но не реагирует с другими вирусами и соком здорового растения. Иммуноглобулиновая фракция из антисыворотки осаждается добавлением равного объема полиэтиленгликоля (молекулярная масса 6000). Полученный осадок растворяют в 0.01М фосфатном буфере,    рН 7.4, содержащем 0.1М NaCl, в течение 18 ч. при 4⁰С. Растворенные иммуноглобулины сорбируются на поверхности полистироловых микроплат в течение 18 ч. при 4⁰С. Затем добавляют 200 мкл раствора антигена в буфере с добавлением 0.05%-ного Tween-20 и инкубируют 1 ч. при 37⁰С. После этого добавляют 200 мкл растворенного в буфере конъюгата (комплекс иммуноглобулинов с пероксидазой хрена) и инкубируют 1 ч. при 37⁰С. Затем в лунки микроплат вносят субстрат – смесь 5-аминоациловой кислоты с Н₂О₂ и инкубируют при комнатной температуре 30 мин. Оптимальная концентрация иммуноглобулина составляет 1-5 мкг/мл, а конъюгата – 1250 нг/мл. Оптическую плотность продукта определяют на фотометре при 490 нм. Метод позволяет обнаружить вирус в концентрации до 10 нг/мл, определять вирус в экстрактах из листьев огурца при разведении до 10^-4, из плодов томатов – до 10^-3, из завязей и плодов огурца (там концентрация вируса меньше) – до 10^-2.

   ПЦР-диагностика.

   Для точной диагностики ВОМ именно ПЦР-диагностика кажется наиболее приемлемой. ПЦР (полимеразная цепная реакция) позволяет избирательно амплифицировать интересующий участок ДНК в миллионы раз за несколько часов, используя в качестве стартового материала сложные смеси ДНК и РНК, являясь фактически реакцией клонирования in vitro. Сущность метода состоит в том, что заранее выбранный участок ДНК служит матрицей для синтеза большого количества копий ДНК. Специфичность метода обеспечивается с помощью пары синтетических олигонуклеотидных праймеров, комплементарных концевым группам нуклеотидов участков с интересующей нас последовательностью. С помощью вектора, способного распознавать комплементарные структуры, из анализируемых сложных смесей захватываются родственные фрагменты ДНК, которые в присутствии ДНК-полимеразы на матрице одноцепочечной ДНК копируются и накапливаются в концентрациях в десятки миллионов раз больших (до микрограммовых количеств), чем их содержалось в исходной смеси. Размеры фрагментов при этом могут составлять от 100 до нескольких тысяч нуклеотидных пар. Это достигается тем, что в каждом цикле (а их может быть 25-30) вновь образующиеся цепи ДНК служат матрицей для синтеза в последующем. При этом примеси – не ограниченные праймерами копии  ДНК – способны за то же время образовать лишь 25-30 таких копий, т.к. синтез идет только с исходных родительских цепей.

   Для ВОМ, генетическим материалом которого служит РНК, необходимо сначала применить ревертазу для обратной транскрипции ДНК с РНК, а затем подвергнуть образовавшиеся комплементарные ДНК стандартной амплификации.

   Метод очень чувствителен и позволяет  определять весьма незначительные количества ДНК патогенов в самых различных материалах.

   Применительно к ВОМ ПЦР-диагностика была использована для определения изолятов в подгруппах, а также для различения ВОМ от вирусов аспермии томатов и карликовости земляного ореха. Метод перспективен для различения ВОМ от вируса мозаики люцерны, имеющего схожий с ВОМ круг хозяев и состав генома.  

    

      
 
 
 
 

 

      

    

 

    2. Вирус некроза огурца. 

1). Общая  характеристика.

   Относится к группе томбасвирусов вместе с  такими вирусами, как вирус кустистой  карликовости томата и вирус крапчатой  морщинистости артишока. Территория распространения вируса ограничена Канадой.

   Вирус содержится в почве, переносится хитридиевым грибом Olpidium cucurbitacearum и легко передается путем механической инокуляции широкому кругу растений. В естественных условиях обнаружен только на парниковых растениях огурца.

   Вирус способен поражать некоторые растения из семейств Amaranthiceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cucurbitaceae, Leguminosae и Solanaceae путем механической инокуляции соком зараженных растений, при этом инфицированными остаются обычно только листья, на которых через 2-5 дней после инокуляции появляются темно-желтые или некротические местные поражения. Инфекция приобретает системный характер только в Cucumus sativus и, реже, в Vigna sinensis и Zinnia elegans; инфекция не приобретает полностью системный характер в других представителях  Cucurbitaceae. Для сохранения культуры вируса широко используются некоторые сорта огурца. 

2). Описание  и свойства вирусных частиц.

   В очищенных препаратах методом дифференциального  центрифугирования выявлен один компонент вируса, в необработанных препаратах также обнаружен добавочный компонент, коэффициент седиментации которого составляет 1/3 от коэффициента основных частиц.

   Молекулярная масса частиц 8.6×10⁶, коэффициент диффузии            1.2×10^-7см²сек^-1, коэффициент седиментации частиц 133S, изоэлектрическая точка рН 3.9.

   Частицы вируса изометрические, 31 нм в диаметре, имеют угловатые очертания.

   Частицы содержат 16% РНК и 18% белка. РНК вируса одноцепочечная. Каждая субъединица белка вируса содержит 391 аминокислотный остаток. Аминокислотный состав: аланин41; аргинин17; аспарагин46; глутамин24; глицин32; гистидин3; изолейцин20; лейцин33; лизин16; метионин1; фенилаланин20; пролин23; серин32; треонин31; триптофан7; тирозин12; валин33.

   При комнатной температуре вирус  сохраняется в соке в течение двух месяцев. После выдерживания вируса в течение одного года в замороженном соке  или сухих листьях отмечено очень слабое уменьшение инфекционности. Вирус осаждается 40%-ным раствором сульфата аммония. На инфекционность вируса в очищенных экстрактах не влияет изменение рН от 4 до 8.  
 

3). Пути распространения и симптоматика.

   Основным  способом передачи вируса в природе  является передача через почву с  зооспорами хитридиевого гриба Olpidium cucurbitacearum. Вирус не переносится внутри покоящихся спор гриба; не содержащие вируса зооспоры выходят как из покоящихся спор, так и из зооспорангиев, образовавшихся в инфицированных вирусом корнях. Также вирус может передаваться при механической инокуляции.

    Вирус поражает парниковые растения  огурца, вызывая образование некротических пятен, тяжелую форму бесформенности листьев и карликовость. 
 
 
 

4). Диагностика  вируса.

   Для диагностики используется 2 метода: индикаторный и серологический.

   Индикаторная  диагностика.

   На  Cucumus sativus вирус вызывает образование некротических поражений, развивающихся на инокулированных листьях за 3-4 дня и увеличивающихся до 3-5 мм; листья засыхают и умирают. Симптомы системного поражения могут включать: хлоротичные или рыжевато-коричневые области с четкими некротическими центрами, которые обычно выпадают из листа, оставляя в листовой пластинке червоточины различных размеров; тяжелая деформация листьев, иногда с темно-зелеными энациями; мелкоплодность, иногда плоды с зеленой мозаикой. Симптомы летом слабо выражены или неясны.

   На  Comphrena globosa вирус вызывает образование беспорядочно расположенных сереющих местных поражений с краснеющими краями, развивающихся за 3-5 дней.

   На  Chenopodium amaranticolor вирус вызывает образование некротических поражений 0.5-1 мм в диаметре, развивающихся за 2-5 дней, края листьев краснеют по мере роста листьев. Тяжело инфицированные листья засыхают и отпадают.

   На  Nicotiana tabacum вирус вызывает образование сереющих некротических пятен до 4 мм в диаметре.

   Серологическая  диагностика.

   Очистка препаратов.

   Следующий метод дает высокоинфективные препараты: смешать 100 г свежих или замороженных листьев с 200 мл 0.67М фосфата натрия в качестве буфера,  рН 7.0, и 50 мл 0.1М аскорбиновой кислоты, профильтровать сок через марлю и центрифугировать при низкой скорости (12500g). Далее препарат очищается добавлением 0.1 объема хлороформа, подвергается закислению до рН 5.3 и дифференциальному центрифугированию либо смешивается с 40%-ным сульфатом аммония и подвергается центрифугированию. Применением центрифугирования в градиенте плотности сахарозы достигается дополнительная очистка препарата.

   Очищенные препараты используются для получения антисывороток. Обычно производится внутримышечная инъекция кроликам, при этом легко получается антисыворотка с предельным разведением более                             1/1000. Полученная антисыворотка используется для диагностических целей.

   Для диагностики вируса из всех методов серологической диагностики наиболее применима реакция двойной диффузии в геле. Для постановки реакции в тонком слое агара на стеклянных пластинках вырезаются лунки: центральная и на расстоянии 1-1.5 см от нее несколько лунок, расположенных радиально. В центральную помещается антисыворотка, в остальные – вирусный препарат либо сок больных растений. Растворы антигена и антител диффундируют навстречу друг другу, и в случае наличия в исследуемом образце вируса, на который приготовлена антисыворотка, наблюдается видимая полоса преципитации. Вирус некроза огурца дает одну полосу преципитации рядом с лункой с антигеном.

   Именно  серологическая диагностика позволяет надежно отличать вирус некроза огурца от вируса некроза табака. Оба вируса имеют схожий круг хозяев и дают на зараженных растениях схожие симптомы, но серологически не родственны. Еще одним преимуществом данного вида диагностики является возможность обнаружения вируса даже в сыром соке.

 

    3. Вирус пятнистости листьев огурца. 

1). Общая  характеристика.