Представление об иммобилизованных ферментах

Федеральное агентство по образованию РФ

ГОУ ВПО  «Тверской государственный технический  университет»

Кафедра биотехнологии и химии 
 
 
 

Реферат 

Представление об иммобилизованных ферментах.

Основные  способы иммобилизации ферментов  в современной биотехнологии 
 
 

Выполнил: студентка 3 курса 

дневного  отделения 

факультета  АС

группы  БТ-0709

Томилина  О. С.

Принял: Карцова С. В. 
 
 
 
 
 
 
 

Тверь 2009

 

Содержание 

 

 

Введение  

     Ферменты  и ферментативные системы традиционно применяются в самых различных областях практической деятельности: в пищевой, фармацевтической, текстильной, кожевенной и других отраслях промышленности, в медицине, сельском хозяйстве, органическом синтезе, химическом анализе и т. д. Тем не менее развитие прикладной энзимологии долгое время сдерживалось дороговизной или полным отсутствием на мировом рынке нужных ферментов, особенно их чистых препаратов. Очевидно, можно ожидать в недалеком будущем благодаря успехам микробиологии коренного решения вопроса производства соответствующих ферментов в достаточном количестве.

     Принципиально новые перспективы открылись  перед прикладной энзимологией в результате создания иммобилизованных ферментов. Дж. Нельсон и Е. Гриффин еще в 1916 г. показали, что инвертаза, адсорбированная на угле (т. е. иммобилизованная), сохраняет каталитическую активность. В  
20 — 30-х годах работы по изучению адсорбции белков и ферментов были продолжены, однако исследования этого периода представляли главным образом академический интерес и не преследовали практических целей. В 1939 г. Дж. Пфанмюллер и Г. Шлейх получили щервый патент на применение адсорбированных на древесных опилках протеолитических ферментов для обработки шкур. Принципиально важный шаг в направлении создания прочных конъюгатов ферментов с носителями был сделан в 1953 г. Н. Грубхофером и Д. Шлейтом, впервые применившими метод ковалентного связывания.

     Для исследований 50 — 60-х годов характерна уже достаточно четкая осознанность практической значимости развиваемого направления. Немалая заслуга в этом принадлежит группам Г. Манеке и Э. Качальского. В результате связывания фермента на носителе были созданы гетерогенные катализаторы, для которых сравнительно недавно, на первой конференции по инженерной энзимологии в Хенникере (США) в 1971 г., был узаконен термин «иммобилизованные ферменты». В литературе все еще встречаются и другие термины, например «нерастворимые ферменты», «матрицированные ферменты» и т. п., смысл которых достаточно конкретен: ими обозначают препараты ферментов, увязанных на нерастворимых носителях. Однако понятие «иммобилизация» можно и нужно понимать шире, а именно, как любое ограничение свободы движения белковых молекул (или их фрагментов) в пространстве [1].

     Первым  иммобилизованным ферментом, примененным в промышленном масштабе, была аминоацилаза. Она была использована в Японии в 1969 г. для производства аминокислот, добавляемых в корм животных. На мировом рынке эта продукция пользуется большим спросом [2].

 

     1 Общая характеристика иммобилизованных ферментов 

     Сущность  иммобилизации ферментов — прикрепление их в активной форме к нерастворимой  основе или заключение в полупроницаемую  мембранную систему. Прикрепление фермента к носителю осуществляется адсорбционно, химической связью или путем механического включения фермента в органический или неорганический гель (в капсулу и т. п.). При этом допускается прикрепление фермента только за счет функциональных групп, не входящих в активный центр фермента и не участвующих в образовании фермент-субстратного комплекса. Носитель фермента или матрица может иметь вид зернистого материала, волокнистой структуры, пластинчатой поверхности, пленок или тканей, полых волокон, трубочек, капсул и т. д. Имеет значение размер частиц носителя. Важно иметь большую поверхность, поэтому рекомендуются небольшие частицы диаметром 0,1 — 0,2 мм. Носитель фермента может быть как природное вещество, так и синтетический полимер [1].

     Преимущества  иммобилизованных ферментов перед  нативными предшественниками:

     1) Гетерогенный катализатор легко отделим от реакционной среды, что дает возможность остановить реакцию в любой момент, использовать фермент повторно, а также получать чистый от фермента продукт.

     2) Ферментативный процесс с использованием иммобилизованных ферментов можно проводить непрерывно, регулируя скорость катализируемой реакции и выход продукта.

     3) Модификация фермента целенаправленно изменяет его свойства, такие как специфичность (особенно в отношении макромолекулярного субстрата), зависимость каталитической активности от рН, ионного состава и других параметров среды, стабильность к денатурирующим воздействиям.

     4) Можно регулировать каталитическую активность иммобилизованных ферментов путем изменения свойств носителя действием физических факторов, таких как свет и звук. Иммобилизовать ферменты можно как путем связывания на нерастворимых носителях, так и путем внутримолекулярной или межмолекулярной сшивки белковых молекул низкомолекулярными бифункциональными соединениями, а также путем присоединения к растворимому полимеру [3]. 

     2 Классификация носителей для ферментов 

     Для получения иммобилизованных ферментов  используется ограниченное число как  органических, так и неорганических носителей. К носителям предъявляются  следующие требования (Дж.Порат, 1974):

– высокая химическая и биологическая стойкость;

– высокая химическая прочность;

– достаточная проницаемость для фермента и субстратов, пористость, большая удельная поверхность;

– возможность получения в виде удобных в технологическом отношении форм (гранул, мембран);

– легкая активация;

– высокая гидрофильность;

– невысокая стоимость.

     Классификация носителей схематично представлена на рисунке 1 [5].

   

   Рисунок 1- Классификация носителей для иммобилизованных ферментов

     Следует отметить, что органические носители (как низко-, так и высокомолекулярные) могут быть природного или синтетического происхождения. Природные полимерные органические носители делят в соответствии с их биохимической классификацией на 3 группы: полисахаридные, белковые и липидные.

     Синтетические полимеры также можно разделить на группы в связи с химическим строением основной цепи макромолекул: полиметиленовые, полиамидные, полиэфирные [4].

     Для иммобилизации ферментов наиболее широко используются природные полисахариды и синтетические носители полиметильного типа, остальные применяются значительно реже. Большое значение природных полимеров в качестве носителей для иммобилизации объясняется их доступностью и наличием реакционно-способных функциональных групп, легко вступающих в химические реакции. Характерной особенностью этой группы носителей также является их высокая гидрофильность. Недостаток природных полимеров – неустойчивость к воздействию микроорганизмов и довольно высокая стоимость.

     Наиболее  часто для иммобилизации используются такие полисахариды, как целлюлоза, декстран, агароза и их производные. Целлюлоза гидрофильна, имеет много гидроксильных групп, что позволяет модифицировать её, замещая эти группы. Для увеличения механической прочности целлюлозу гранулируют путем частичного гидролиза, в результате которого разрушаются аморфные участки. На их место для сохранения пористости между кристаллическими участками вводят химические сшивки. Гранулированную целлюлозу довольно легко превратить в различные ионообменные производные, такие как  
ДЭАЭ-целлюлоза, КМЦ и т.д.

     Широко  распространены носители на основе декстрана, выпускаемые под названием "сефадексы". При высушивании они легко  сжимаются, в водном растворе сильно набухают. В этих носителях размер пор в геле регулируется степенью сшитости. К группе декстранов относят и крахмал. Химически модифицированный крахмал сшивается агентами, такими как формальдегид. Таким способом был получен губчатый крахмал, обладающий повышенной устойчивостью по отношению к ферментам, гидролизу. Водорастворимые препараты на основе декстрана часто применяются как носители лекарственных средств в медицине.

     Хорошим носителем считается агар. Его  свойства улучшаются после химической сшивки, например, диэпоксидными соединениями. Такой агар становится устойчивым к  нагреванию, прочен, легко модифицируется.

     Белки в качестве носителей обладают рядом  достоинств: вместительны, способны к  биодеградации, могут применяться  в качестве тонкой (толщиной 80 мкм) мембраны. Иммобилизацию ферментов на белковых носителях можно проводить как  в отсутствие, так и в присутствии сшивающих агентов. Белки используются и в фундаментальных биологических исследованиях, и в медицине. К недостаткам белков в качестве носителей относят их высокую иммуногенность (за исключением коллагена и фибрина). Наиболее часто для иммобилизации используются структурные (кератин, фибрин, коллаген), двигательные (миозин) и транспортные (альбумин) белки.

     Синтетические полимерные носители применяются для  ковалентной и сорбционной иммобилизации  ферментов, для получения гелей, микрокапсул. Полимеры на основе стирола применяются сорбционной иммобилизации. Они могут иметь макропористую, изопористую структуру, а также гетеропористую структуру. Для получения полимерных гидрофильных носителей широко используется акриламид - производное акриловой кислоты [3].

     Широкое распространение получил метод  включения ферментов и клеток в полиакриламидный гель, имеющий  жесткую пространственную сетчатую структуру. Полиакриламидный гель устойчив к химическим воздействиям. Очень  интересную группу представляют полиамидные носители. Это группы различных гетероцепных полимеров с повторяющейся амидной группой -С(О)-NH-. Например, полимеры на основе N-винилпирролидона используются для получения иммобилизованных ферментов, способных медленно распадаться в организме. Кроме того, они биологически инертны, что особенно важно при использовании в медицинских целях. Существенным недостатком большинства полимерных носителей является их способность накапливаться в организме. В этом отношении предпочтение отдается природным полимерам, которые гидролизуются ферментами. Поэтому в состав лекарственных препаратов часто входит декстран, а из синтетических носителей - полимеры на основе N-винилпирролидона. В настоящее время ведутся эксперименты по созданию синтетических полимеров, расщепляющихся с образованием нетоксичных продуктов обмена [5]. 

     3 Методы иммобилизации ферментов 

     Существует  два основных метода иммобилизации  ферментов: физический и химический.  

     3.1 Физическая иммобилизация  ферментов 

     Физическая  иммобилизация ферментов представляет собой включение фермента в такую среду, в которой для него доступной является лишь ограниченная часть общего объема. При физической иммобилизации фермент не связан с носителем ковалентными связями. Существует четыре типа связывания ферментов:

– адсорбция на нерастворимых носителях;

– включение в поры геля;

– пространственное отделение фермента от остального объема реакционной системы с помощью полупроницаемой перегородки (мембраны);

– включение в двухфазную среду, где фермент растворим и может находиться только в одной из фаз.