Методология микробиологии и вирусологии

Лазерная рентгеновская микроскопия.

Лазерная рентгеновская  микроскопия — разновидность рентгеноструктурного анализа, основанного на дифракции рентгеновских лучей на исследуемом объекте. В отличие от традиционного рентгеноструктурного анализа, исследуется одиночные молекулы и их сочетания.

Для получения и дальнейшей регистрации дифракционной картины  на одиночном объекте требуется:

высокая концентрация энергии  излучения на исследуемом объекте  как из-за его размера (традиционный рентгеноструктурный анализ имеет  дело с кристаллами из исследуемых  объектов), так и из-за ограниченной чувствительности принимающей аппаратуры (при недостаточной энергии не удастся зафиксировать картину);

малое время экспонирования, так как вследствие высокой концентрации энергии объект неизбежно разрушается  излучением. Характерные временные  интервалы — несколько фемтосекунд (10−15 с);

высокая пространственная когерентность излучения (длина  когерентности должна быть по крайней мере сравнима с длиной оптического пути прибора), в противном случае из-за малого времени экспонирования возникающее искажение фазы не позволит сформировать устойчивую дифракционную картину.

Сканирующая зондовая микроскопия.

Работа сканирующего зондового  микроскопа основана на взаимодействии поверхности образца с зондом (кантилевер, игла или оптический зонд). При малом расстоянии между поверхностью и зондом действие сил взаимодействия (отталкивания, притяжения, и других сил) и проявление различных эффектов (например, туннелирование электронов) можно зафиксировать с помощью современных средств регистрации. Для регистрации используют различные типы сенсоров, чувствительность которых позволяет зафиксировать малые по величине возмущения. Для получения полноценного растрового изображения используют различные устройства развертки по осям X и Y (например, пьезотрубки, плоскопараллельные сканеры).

Основные технические  сложности при создании сканирующего зондового микроскопа:

Конец зонда должен иметь  размеры сопоставимые с исследуемыми объектами.

Обеспечение механической (в том числе тепловой и вибрационной) стабильности на уровне лучше 0,1 ангстрема.

Детекторы должны надежно  фиксировать малые по величине возмущения регистрируемого параметра.

Создание прецизионной системы развёртки.

Обеспечение плавного сближения  зонда с поверхностью.

Культуральный метод (бактериологический, вирусологический);

совокупность методик  искусственного культивирования микроорганизмов  на питательных средах в целях  их идентификации при установлении д-за инфекционного заболевания  или иного вызванного микробами  процесса и определения ряда физиологических  свойств культуры с др. целями, напр., при выборе химиотерапевтического препарата. Современные методы изучения большинства биол. св-в бактерий возможны только при наличии чистой культуры (см.). Контаминация культуры др. видом микробов, как правило, ведет к искажению результатов и неправильному заключению. Поэтому первой задачей Б.м. является получение чистой культуры какого-либо вида (вара) из микробной ассоциации и предупреждение контаминации посторонней микрофлорой материала для исследования и микробной культуры на всех этапах исследования. Это возможно при заборе материала в стерильных условиях в стерильную посуду, посеве материала в стерильные среды стерильным инструментом, предупреждении попадания микробов из воздуха в процессе доставки, хранения и инкубации материала и засеянных питательных сред. Вторая задача Б.м. - идентификация микробов (см.) выделенной чистой культуры, третья - определение дополнительных свойств, напр., чувствительности к антибиотикам, вирулентности. Этапы Б.м.: 1) забор материала (см. Материалы для исследования) и его доставка в бактериол. лабораторию; 2) микроскопия иссл. материала (см. Бактериоскопический метод). Этот этап часто не выполняется, хотя, несмотря на меньшую чувствительность, предварительная микроскопия в ряде случаев дает ориентировочные сведения о возбудителе и позволяет выбрать необходимые для посева среды; 3) обработка иссл. материала физ. или хим. факторами в целях удаления или уменьшения посторонней микрофлоры. Эта мера применяется, напр., при исследовании мокроты, выделении кислотоустойчивых и спорообразующих микробов; 4) посев иссл. материала (см. Посевы бактериологические) на питательные среды для получения изолированных колоний; 5) инкубация засеянных питательных сред. Сроки и температура инкубации зависят от предполагаемой видовой принадлежности культуры. Обычно посевы выдерживают в термостате при 37°С 1-2 дня. Если рост отсутствует, срок инкубации может быть продлен еще на 2 - 3 дня. При более длительной инкубации необходимо предупредить высыхание среды, для чего посевы помещают в эксикатор с водой или пробки пробирок заливают парафином; 6) исследование колоний (см.). Для изучения выбирают однородные изолированные колонии, располагающиеся далеко от краев чашки и по штриху петли, окружают их чертой, нумеруют. Если исследование ведется ненаправленно (полиэтиологичный процесс и пр.), то на основании результатов визуального осмотра выбирают по 2 - 3 колонии всех имеющихся на чашке типов и делают с них мазки; 7) пересев с выбранных колоний на среды накопления. Для этого с остатка колонии, в мазке к-рой выявлены однородные по форме и окраске бактерии, петлей, стараясь не задеть соседние колонии, забирают часть культуры и засевают на скошенный в пробирке МПА или специальную среду штрихом; 8) инкубация посевов в термостате до появления сплошного роста (обычно 1 -2 дня); 9) определение чистоты выросшей на скошенных средах культуры путем макроскопического осмотра роста и микроскопии мазка из него; 10) идентификация выделенной чистой культуры и в случае необходимости (по требованию клинициста, эпидемиолога) определение различных биол. свойств; 11) заключение о видовой принадлежности выделенной культуры и ее свойствах. Заключение дается на официальном бланке со ссылкой на номер, под которым она занесена в лабораторный журнал. Б.м. является основным в диагностике большинства бактер. инфекций. Он, как правило, обладает высокой чувствительностью, позволяющей выделить из, иссл. материала чистую к-ру, даже если в посевной дозе материала содержалось несколько десятков особей. Для Б.м. характерна высокая специфичность. Выделение того или иного вида бактерий из патологического материала при соблюдении ряда условий (см. Возбудитель болезни) надежно устанавливает этиологию патологического процесса. Исключение составляют условно-патогенные аутохтонные для того или иного биотопа бактерии, для определения роли которых нужны специальные критерии, а также разграничение носительства и заболевания (напр., дифтерийное носительство при стрептококковой ангине). Ценность Б.м. состоит также в том, что с его помощью могут быть установлены свойства культуры, необходимые для назначения химио- и серотерапии, выявления источника инфекции и механизмов передачи возбудителя, выбора противоэпидемических мероприятий. Наконец, Б.м. относится к ранним методам диагностики. Недостатки Б. м. - опасность инфицирования, сложность, трудоемкость, длительность. Достоверные данные о составе микрофлоры и ее свойствах можно получить только при исследовании выборки из 3 -10 к-р.

биологический метод

Биологические методы исследований направлены на определение наличия  токсинов возбудителя в исследуемом  материале и на обнаружение возбудителя (особенно при незначительном исходном содержании в исследуемом образце). Методы включают заражение лабораторных животных исследуемым материалом с последующим выделением чистой культуры патогена либо установлением факта присутствия микробного токсина и его природы. Моделирование экспериментальных инфекций у чувствительных животных — важный инструмент изучения патогенеза заболевания и характера взаимодействий внутри системы микроорганизм-макроорганизм. Для проведения биологических проб используют только здоровых животных определённых массы тела и возраста. Инфекционный материал вводят внутрь, в дыхательные пути, внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно, внутрикожно и подкожно, в переднюю камеру глаза, через трепанационное отверстие черепа, субокципитально (в большую цистерну головного мозга). У животных прижизненно забирают кровь, экссудат из брюшины, после гибели — кровь, кусочки различных органов, СМЖ, экссудат из различных полостей.

Серологические  методы

Серологические методы исследований выявления специфических AT и Аг возбудителя — важный инструмент в диагностике инфекционных заболеваний. Особую ценность они имеют в тех случаях, когда выделить возбудитель не представляется возможным. При этом необходимо выявить повышение титров AT, в связи с чем исследуют парные образцы сыворотки, взятые в интервале 10-20 сут (иногда этот интервал может быть более длительным). AT обычно появляются в крови на 1-2-ю неделю заболевания и циркулируют в организме относительно долго, что позволяет использовать их выявление для ретроспективных эпидемиологических исследований. Определение классов Ig чётко характеризует этапы инфекционного процесса, а также может служить косвенным прогностическим критерием, Особое значение имеют методы выявления микробных Аг. В значимых количествах они появляются уже на самых ранних сроках, что делает их идентификацию важным инструментом экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, а количественное их определение в динамике инфекционного процесса служит критерием эффективности проводимой антимикробной терапии.

Молекулярно – генетические методы

К прямым методам обнаружения  микобактерий туберкулеза можно  отнести и бурно развивающиеся  в последние годы подходы, сущность которых состоит в выявлении  в исследуемых образцах диагностического материала специфических фрагментов цепи ДНК возбудителя. Среди применяемых для этого молекулярно-биологических методик наиболее широкое распространение получил метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), в основе которого лежит многократное увеличение числа копий специфического участка ДНК (так называемая направленная амплификация ДНК): 20 циклов ПЦР приводят к увеличению исходной ДНК в 1 миллион раз, что позволяет визуализировать результаты методом электрофореза в агарозном геле. Очень высокий уровень чувствительности (95 % и более), являющийся главным достоинством метода, достигается за счет того, что в результате многократного копирования уровень специфической олигонуклеотидной последовательности в редакционной пробе возрастает в 106 раз. По своей чувствительности метод ПЦР при туберкулезе органов дыхания в два раза превосходит эффективность культуральной диагностики.

Области микробиологии.

За время существования  микробиологии сформировались общая, техническая, сельскохозяйственная, ветеринарная, медицинская, санитарная ветви.

Общая изучает наиболее общие закономерности, свойственные каждой группе перечисленных микроорганизмов: структуру, метаболизм, генетику, экологию и т. д.

Техническая занимается разработкой биотехнологии синтеза микроорганизмами биологически активных веществ: белков, нуклеиновых кислот, антибиотиков, спиртов, ферментов, а также редких неорганических соединений.

Сельскохозяйственная  исследует роль микроорганизмов  в круговороте веществ, использует их для синтеза удобрений, борьбы с вредителями.

Ветеринарная изучает возбудителей заболеваний животных, методы диагностики, специфической профилактики и этиотропного лечения, направленного на уничтожение возбудителя инфекции в организме больного животного.

Медицинская микробиология  изучает болезнетворные (патогенные) и условно-патогенные для человека микроорганизмы, а также разрабатывает методы микробиологической диагностики, специфической профилактики и этиотропного лечения вызываемых ими инфекционных заболеваний.

Санитарная микробиология  изучает санитарно-микробиологическое состояние объектов окружающей среды, пищевых продуктов и напитков, и разрабатывает санитарно-микробиологические нормативы и методы индикации  патогенных микроорганизмов в различных  объектах и продуктах.