Методология микробиологии и вирусологии

Северо-Восточный  Государственный Университет

2012 год :)

Доклад

Методология микробиологии и вирусологии

Александр Дробиков

Методология микробиологии  зародилась с описательного этапа. Он получил развитие когда человечество изобрело микроскоп.

К методам исследования любых микроорганизмов относят:

• микроскопия: световая, фазово-контрастная, темнопольная, флуоресцентная, электронная;
• культуральный метод (бактериологический, вирусологический);
• биологический метод (заражение лабораторных животных с воспроизведением инфекционного процесса на чувствительных моделях);
• молекулярно-генетический метод (ПЦР, ДНК- и РНК-зонды и др.);
• серологический метод — выявления антигенов микроорганизмов или антител к ним (ИФА).

Цель медицинской микробиологии  – глубокое изучение структуры и  важнейших биологических свойств  патогенных микробов, взаимоотношения  их с организмом человека в определенных условиях природной и социальной среды, совершенствование методов  микробиологической диагностики, разработка новых, более эффективных лечебных и профилактических препаратов, решение  такой важной проблемы, как ликвидация и предупреждение инфекционных болезней.

Микроскопия (МКС) (греч. μΙκροσ — мелкий, маленький и σκοποσ — вижу) — изучение объектов с использованием микроскопа. Подразделяется на несколько видов: оптическая микроскопия, электронная микроскопия, многофотонная микроскопия, рентгеновская микроскопия или рентгеновская лазерная микроскопия, отличающиеся использованием электромагнитных лучей с возможностью рассмотрения и получения изображений микроэлементов вещества в зависимости от разрешающей способности приборов (микроскопов). До создания рентгеновских микроскопов работали с оптическими приборами, использующими лучи видимого света, так как и глаз работает в оптическом диапазоне длин волн. Соответственно, оптические микроскопы не могли иметь разрешения менее полупериода волны опорного излучения (для видимого диапазона длина волн 0,4—0,7 мкм, или 400—700 нм) c возможным максимальным увеличением в 2000 раз.

Идея просвечивающего  электронного микроскопа состояла в  замене опорного электромагнитного  излучения на электронный пучок. Известно, что для увеличения разрешения микроскопов, использующих электромагнитное излучение, необходимо уменьшение длины  волны электромагнитного излучения  до ультрафиолетового диапазон вплоть до рентгеновского (длина волны сопоставима  с межатомными расстояниями в  веществе) и основная трудность состоит  в фокусировке ультрафиолетовых и, тем более, рентгеновских лучей. Получение изображений микрочастиц осуществляется путём использования соответствующих оптических систем — микроскопов.

Степень проникновения  в микромир, его изучения зависит  от возможности рассмотреть величину микроэлемента, от разрешающей способности  прибора.

Если уже достигнут предел величины объекта, выше которого его границы сливаются из-за дифракции лучей, и на изображении границы нельзя различить, дальнейшее увеличение изображения исследуемой частицы теряет смысл.

В оптической микроскопии  в настоящее время сделан прорыв, в результате которого преодолен  фундаментальный рэлеевский критерий, заключающийся в том, что минимальный размер различимого объекта несколько меньше длины волны используемого света и принципиально ограничен дифракцией излучения. Это был предел возможному в оптической микроскопии. До недавнего времени нельзя было преодолеть баръер, позволяющий различать структуры с расстоянием между элементами до 0,20 мкм.

Тем не менее выдающаяся последняя разработка оптической системы наноскопа с оптическим разрешением 10 нм расширило диапазон оптической микроскопии — наноскопии до десятков нанометров, что по сравнению с 0,20 мкм в 20 раз сократило расстояние между различаемыми элементами. (Например, размер белковых молекул, из которых состоит наш организм, колеблется от 3 до 10 нм).

Гораздо более высокое  разрешение имеют электронные микроскопы. В 2011 году лучшее разрешение для Растрового электронного микроскопа было 0,4 нм, и лучшее разрешение Просвечивающего электронного микроскопа было 0,05 нм.

Оптическая микроскопия.

Человеческий глаз представляет собой биологическую оптическую систему, характеризующуюся определённым разрешением, т. е. наименьшим расстоянием  между элементами наблюдаемого объекта (воспринимаемыми как точки или  линии), при котором они ещё  могут быть отличены один от другого. Для нормального глаза при  удалении от объекта на т. н. расстояние наилучшего видения (D = 250 мм), среднестатистическое нормальное разрешение составляет 0,176 мм. Размеры микроорганизмов, большинства  растительных и животных клеток, мелких кристаллов, деталей микроструктуры металлов и сплавов и т. п. значительно  меньше этой величины. Для наблюдения и изучения подобных объектов и предназначены  микроскопы различных типов. С помощью  микроскопов определяли форму, размеры, строение и многие другие характеристики микрообъектов. Оптический микроскоп  в видимом свете давал возможность  различать структуры с расстоянием  между элементами до 0,20 мкм. Так было до создания оптического микроскопа наноскопа.

Фазово-контрастная  микроскопия — метод получения изображений в оптических микроскопах, при котором сдвиг фаз электромагнитной волны трансформируется в контраст интенсивности. Фазово-контрастную микроскопию открыл Фриц Цернике, за что получил Нобелевскую премию за 1953 год.

Для получения фазово-контрастного изображения свет от источника разбивается на два когерентных световых луча, один из них называют опорным, другой предметным, которые проходят разные оптические пути. Микроскоп юстируют таким образом, чтобы в фокальной плоскости, где формируется изображение, интерференция между этими двумя лучами гасила бы их. Длину оптического пути изменяют с помощью так называемой фазовой пластинки, расположенной на фазовом кольце. Когда на пути одного из лучей находится образец, преломление света в нём изменяет оптический путь, а, следовательно, и фазу, что изменяет условия интерференции.

Фазово-контрастная микроскопия  особенно популярна в биологии, поскольку  не требует предварительного окрашивания  клетки, из-за которого она может  погибнуть.

Темнопольная оптическая микроскопия — вид оптической микроскопии, в которой контраст изображения увеличивают за счет регистрации только света, рассеянного изучаемым образцом. При использовании метода темного поля регистрируются даже незначительные различия в преломляющей способности участков препарата. Основы метода разработаны Р. Зигмонди в 1906 году.

В оптической микроскопии  тёмного поля неоднородности образца  рассеивают свет, и этот рассеянный свет формирует изображение исследуемого образца.

Особенностью микроскопа темного поля является способ освещения  образца, который осуществляется «сбоку» (зеленая полоса на рисунке). При  таком освещении неоднородности, имеющиеся в образце, рассеивают падающий свет и в микроскопе изображение  образца наблюдают в рассеянном свете, а освещающий свет «напрямую» не попадает в объектив. Такое освещение называется эпи-подсветкой (EPI-illuminator, EPI—microscope, EPI-objective lens).

Для прозрачных объектов возможно и контровое освещение, но при этом необходимы дополнительные действия, чтобы убрать "прямое поле": необходимо провести фурье-преобразование полученного изображения и удалить из полученной суммы компоненту, соответствующую "опорной" волне. Это можно сделать, например, с помощью линзы и шаблона, закрывающего небольшой участок в плоскости, где линзой фокусируется "опорная" световая волна. Затем, с помощью второй линзы проводят обратное преобразование Фурье и наблюдают полученную картину визуально. При этом контраст исходного изображения существенно возрастает.

В микроскопах использование  метода тёмного поля может быть предусмотрено конструкцией или реализуется установкой дополнительных узлов.

Флуоресцентная  микроскопия — метод получения увеличенного изображения с использованием люминесценции возбуждённых атомов и молекул образца. В флуоресцентном микроскопе образец облучается светом с большей частотой, а изображение получают в оптическом спектре. Излучение образца, соответственно, пропускается через фильтр, отсекающий свет на частоте возбуждения. Изображение флуоресцентного препарата может сфотографировано специализированной цифровой камерой, позволяющей делать снимки с большой выдержкой. Для некоторых изображений это время может достигать 60 минут.

Одним из видов флуоресцентной микроскопии является конфокальная микроскопия — метод, позволяющий  получать изображения с некоторой  глубины в середине образца. Простейший метод, с помощью которого можно  исследовать поверхность, называют эпифлуоресцентной микроскопией.

Электронная микроскопия.

Электронный микроскоп (ЭМ) — прибор, позволяющий получать изображение объектов с максимальным увеличением до 106 раз, благодаря использованию, в отличие от оптического микроскопа, вместо светового потока пучка электронов с энергиями 200 В ÷ 400  кэВ и более (например, просвечивающие электронные микроскопы высокого разрешения с ускоряющим напряжением 1 МВ). Разрешающая способность электронного микроскопа в 1000÷10000 раз превосходит разрешение светового микроскопа и для лучших современных приборов может быть меньше одного ангстрема. Для получения изображения в электронном микроскопе используются специальные магнитные линзы, управляющие движением электронов в колонне прибора при помощи магнитного поля.

Рентгеновская микроскопия.

Рентгеновский микроскоп — устройство для исследования очень малых объектов, размеры которых сопоставимы с длиной рентгеновской волны. Основан на использовании электромагнитного излучения с длиной волны от 0,01 до 1 нанометра.

Рентгеновские микроскопы по разрешающей способности находятся  между электронными и оптическими  микроскопами. Теоретическая разрешающая  способность рентгеновского микроскопа достигает 2-20 нанометров, что на порядок  больше разрешающей способности  оптического микроскопа (до 150 нанометров). В настоящее время существуют рентгеновские микроскопы с разрешающей  способностью около 5 нанометров.