Контрольная работа по "Биотехнология"

Министерство сельского хозяйства Российской Федерации

ФГБОУ ВПО

Государственный аграрный университет Северного Зауралья

Кафедра

«»

 

 

 

Контрольная работа

По дисциплине: Биотехнология

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Выполнил:     Проверил:	ЯгольниковаИ.И. Гр. 3МБ

 

Тюмень, 2015.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Клональное микроразмножение растений

Для семенных растений характерно два способа размножения: семенной и вегетативный. Оба эти способа имеют как преимущества, так и недостатки. К недостаткам семенного размножения следует отнести, в первую очередь, генетическую пестроту получаемого посадочного материалa и длительностьювенильного периода. При вегетативном размножении сохраняется генотип материнского растения и сокращается продолжительность ювенильного периода. Однако для большинства видов (в первую очередь для древесных пород) проблема вегетативного размножения остается до конца не решенной. Это обусловлено следующими причинами:

• не все породы, даже на ювенильной стадии, могут размножаться вегетативным способом с требуемой эффективностью (дуб, сосна, ель, орехоплодныеи др.);
• практически невозможно с помощью черенкования размножать многие виды древесных пород в возрасте старше 10—15 лет;
• не всегда удается получать стандартный посадочный материал (возможность накопления и передачи инфекции);
• трудоемкостью и сложностью операций при размножении взрослых (древесных) растений с помощью прививок;
• неэффективностью разработанных технологий для получения достаточного количества генетически однородного материала в течение года.

Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения — клонального микроразмножения (получение в условиях in vitro (в пробирке), неполовым путем растений, генетически идентичных исходному экземпляру). В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность, то есть под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму. Этот метод, несомненно, имеет ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения:

• получение генетически однородного посадочного материала;
• освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры;
• высокий коэффициент размножения (105-106-для травянистых, цветочных растений, 104-105 -для кустарниковых древесных, 104-для хвойных);
• сокращение продолжительности селекционного процесса;
• ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития;
• размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами;
• возможность проведения работ в течение года и экономия площадей, необходимых для выращивания посадочного материала

Клональное размножение - это использование техники ин витро для быстрого неполового получения растений, идентичных исходному. Обязательным условием клональногомикроразмножения является использование объектов, полностью сохраняющих генетическую стабильность на всех этапах.  
Этому условию удовлетворяют апексы и пазушные почки органов стеблевого происхождения. самой крупномасштабной областью применения клональногомикроразмножения является быстрое размножение вновь созданных и уже существующих ценных хозяйственных сортов с целью получения массового оздоровленного посадочного материала, освобожденного от вирусной инфекции.

Микроклональное размножение

Получение растений, свободных от вирусной инфекции, — только первый шаг использования их в семеноводстве. Следующая важная задача- их ускоренное размножение. Кроме того, сам по себе метод микроклонального размножения дает возможность получать в больших количествах растения у таких культур, которые с трудом или совсем не размножаются вегетативно, а также быстро размножить уникальный генотип, например, новый сорт.  
Метод позволяет поддерживать на относительно небольшой площади в лабораторных условиях круглогодичный рост растений, что дает возможность планировать их выпуск к определенному сроку. Наконец, благодаря этому методу появилась реальная возможность создания «банка» или коллекции ценных культур.

В настоящее время существует несколько подходов к клональному микроразмножению растений в культуре ин витро:

1) получение каллусной ткани с последующей индукцией органогенеза;

2) индукция развития побегов  непосредственно из ткани эксплантата;

3) пролиферация пазушных  побегов.

Эти способы имеют различные коэффициенты размножения, различную степень надежности в отношении сохранения генетической стабильности размножаемых форм растений, а также различаются универсальностью и повторяемостью п Пионером клонального микроразмножения считается французский ученый Жан Морель, который в 50-х годах двадцатого века получил первые растения - регенеранты орхидей. В это время техника культивирования апикальных меристем in vitro была уже хорошо разработана. Как правило, исследователи в качестве первичного экспланта использовали верхушечные меристемы травянистых растений: гвоздики, хризантемы, подсолнечника, гороха, кукурузы и т.д. В нашей стране работы по клональному микроразмножению были начаты в 30-х годах в лаборатории культуры тканей и морфогенеза ИФРа. Под руководством Р.Г.Бутенко были изучены условия микроразмножения картофеля, сахарной свеклы, гвоздики, герберы и др. растений и предложены промышленные технологии. В дальнейшем исследования по клональному микроразмножении охватили и древесные растения.

Первые работы по культуре тканей древесных растений были опубликованы в середине 20-х годов нашего столетия и связаны с именем Готре, который показал, что камбиальные ткани некоторых растений способны к каллусогенезу in vitro. Но первые растения - регенеранты осины, доведенные до почвенной культуры, были получены лишь в середине 60-х годов Матесом.

Культивирование тканей хвойных пород in vitro долгое время редко использовалось как объект исследования. Это было связано со специфическими трудностями культивирования тканей, изолированных из растения. Известно, что древесные, и особенно хвойные растения характеризуются медленным ростом, трудно укореняются, содержат большое количество вторичных соединений (фенолы, терпены и т.д.), которые в изолированных тканях активируются. Окисленные фенолы обычно ингибируют деление и рост клеток, что ведет к гибели первичного экспланта или уменьшению способности тканей древесных растений к регенерации адвентивных почек, которая с возрастом растения-донора исчезает практически полностью. В настоящее время, несмотря на перечисленные трудности, насчитывается более 200 видов древесных растений из 40 семейств, которые были размножены in vitro (каштан, дуб, береза, клен, сосна, ель, секвойя и др.).

олучаемых результатов.

Факторы, влияющие на процесс клонального микроразмножения

 

На эффективность микроклонального размножения влияет масса факторов различной природы. Это физиологические особенности вводимого в культуру растения, химические и физические условия культивирования. Наиболее важным моментом является выбор материнского растения и экспланта.

При выборе материнского растения необходимо учитывать его физиологические, сортовые и видовые особенности. Исходные растения должны быть здоровы, не поражены грибными, бактериальными и вирусными болезнями. Кроме того, они должны находится в состоянии интенсивного роста (выход из фазы покоя и переход к активному росту). Луковицы, корневища и клубни в состоянии покоя непригодны, перед введением в культуру их предварительно обрабатывают высокими или низкими температурами. Способность к размножению также детерминирована генетически. Например, земляника размножается всеми способами, облепиха – ни одним, хотя в природе черенкуется. Двудольные обладают большей регенерационной способностью, чем однодольные и древесные.

При выборе экспланта необходимо учитывать его возраст, строение и происхождение. Для обеспечения максимальной стабильности клонируемого материала, во избежание появления аномальных растений в качестве экспланта желательно использовать молодые, слабодифференцированные ткани. Кроме того, экспланты от ювенильных растений лучше укореняются, чем от зрелых, особенно это касается древесных пород. Лучше всего использовать кончики стеблей, пазушные почки, зародыши, молодые листья, черенки, соцветия, чешую луковиц, то есть экспланты, содержащие меристемы. Опыты с эмбрионами кукурузы, проведенные Грином и Филипсом в 1975 году, показали, что при извлечении эмбрионов из зрелых семян они образуют каллус и корни. Если же изолировать их через 2 – 3 недели после опыления, то образуются и каллус, и растения.  Вероятно, это связано с разворачиванием генетической программы в онтогенезе растения. Следует отметить, что не всегда молодые ткани являются удачным объектом для размножения. У эхеверии на эксплантах из молодых листьев возникают только корни, из старых – только побеги, из средних по возрасту – и побеги, и корни. Чем меньше размер экспланта, тем меньше его регенерационная способность. С другой стороны, в крупном экспланте увеличивается возможность появления в его клетках вирусов и других патогенов, что препятствует оздоровлению тканей.

Длительность культивирования также влияет на эффективность микроразмножения. Физиологическое состояние экспланта меняется в течение пассажей, при длительном культивировании частота укореняемости побегов возрастает. Возможно, что при этом эксплант приобретает признаки ювенильности, что ведет к повышению его морфогенетического потенциала.

Успех введения в культуру часто определяется эффективностью стерилизации. Выбор стерилизующего агента определяется особенностями экспланта. Для нежных тканей концентрация стерилизующего агента должна бать снижена, чтобы сохранить жизнеспособность экспланта. Часто внутреннее заражение исходных эксплантов бывает намного сильнее, чем поверхностное, поэтому экспланты предварительно обрабатывают фунгицидами и антибиотиками против грибной и бактериальной инфекций. Хорошие результаты дает обработка растений бензоатом натрия.

В зависимости от вида растений необходимо испытывать как твердые, так и жидкие питательные среды. Иногда жидкие среды имеют преимущество, так как обеспечивают большую подвижность трофических элементов. Например, при размножении роз более успешным было культивирование побегов на двухслойной питательной среде: нижний слой – агаризованный, верхний – жидкий. На эффективность размножения могут также влиять расположение экспланта (горизонтальное или вертикальное), тип пробок (ватные, пластмассовые, стеклянные, металлические и т.д.), а также соотношение объема эксплантов и количества питательной среды для оптимального освещения и газообмена эксплантов.

Состав питательной среды необходимо подбирать для каждого вида растений. На клональное микроразмножение влияют гормоны, минеральные соли, витамины и углеводы. При микроразмножении in vitro часто используют среды Мурасиге и Скуга, Линсмайера и Скуга, Шенка и Хильдебрандта, Нича, Гамборга, Хеллера и другие. Обычно используют среду Мурасиге–Скуга, которая содержит много неорганического азота, что стимулирует процессы органогенеза и соматического эмбриогенеза. В наших экспериментах (Кузьмина Н.А., Внукова В.В., 1997) выход морфогенных каллусов твердой пшеницы был выше на среде Мурасиге-Скуга по сравнению со средой Гамборга, которая одержала окисленные формы азота. Среда Мурасиге-Скуга также способствовала стабилизации хромосомного набора клеток твердой пшеницы при высоком содержании ауксина в среде. Вообще вопрос оптимального соотношения NH4: NO3 остается открытым, так как литературные данные весьма противоречивы и универсального рецепта для всех видов растений нет. В качестве источника углеродного питания используют различные углеводы типа сахарозы, глюкозы, фруктозы, галактозы. Разные культуры требуют различной концентрации углеводов на разных этапах клонального микроразмножения.

К физическим факторам выращивания относятся температура и условия освещения. На первых двух этапах освещенность колеблется от 1000 до 3000 Лк, фото период 14 – 16 часов, но эти параметры зависят от культуры. Высокая интенсивность света может вызывать хлорозы и задерживать развитие, но при переносе в почву эти растения чувствуют себя лучше и растут энергичнее. Спектральный состав также играет немаловажную роль. Некоторые исследователи (Катаева Н.В., Аветисов В.А, 1981) указывают на синий свет как основной компонент морфогенеза. Красный свет стимулирует образование почек у табака, у салата – образование побегов, у березы – укоренение. В работах Т.Н. Константиновой с соавторами (1987) показано, что синий свет усиливает закладку вегетативных почек у побегов табака в условиях in vitro, а красный стимулирует развитие цветочных почек. Однако при добавлении цитокининов и ауксинов в различной концентрации соотношение процессов дифференциации цветочных и вегетативных почек меняется, в некоторых случаях наблюдается даже противоположный эффект. В исследованиях Р. А. Карначук и Е. С. Гвоздевой (1998) наибольший выход морфогенных каллусов пшеницы, формирующих растения и побеги, отмечен на зеленом свету. Важное значение играет также сочетание спектрального состава света и гормональных факторов среды.

Температура культивирования обычно варьирует в интервале 22 – 26оС днем и 18 – 22оС ночью. В некоторых случаях понижение температуры ведет к повышению эффективности размножения. Для повышения коэффициента размножения необходимо каждому виду с учетом его естественного ареала произрастания подбирать индивидуальные условия культивирования. Относительная влажность воздуха – 65 – 70%

Этапы микроклонального размножения растений

Процесс клонального микроразмножения можно разделить на 4 этапа:

1. Выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры.

2. Собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества меристематических клонов.

3. Укоренение размноженных  побегов с последующей адаптацией  их к почвенным условиям, а  при необходимости депонирование  растений-регенерантов при пониженной температуре (+2оС, +10оС).

4. Выращивание растений  в условиях теплицы и подготовка  их к реализации или посадке  в поле.

Для культивирования тканей на каждом из четырех этапов требуется применение определенного состава питательной среды.

На первом этапе необходимо добиться получения хорошо растущей стерильной культуры. В тех случаях, когда трудно получить исходную стерильную культуру экспланта, рекомендуется вводить в состав питательной среды антибиотики (тетрациклин, бензилпенициллин и др.) в концентрации 100—200 мг/л. Это в первую очередь относится к древесным растениям, у которых наблюдается тенденция к накоплению внутренней инфекции.