Использование аффинной хромотографии для оценки качества полимеров на основе природного сырья

Для разделения изоферментов лактатдегидрогеназы  Броделиус и Мосбах использовали сефарозу с присоединенными аналогами АМР; при элюировании растворами с возрастающей концентрацией NАDН получены пять пиков изоферментов (рис.2). Разделение достигается благодаря различиям в константах диссоциации К_дис двойного комплекса фермент - NАDН. Позднее Броделиус и Мосбах аналогичным образом хроматографировали ряд лактатдегидрогеназ нз различных источников, константы которых известны.

Рис. 3. Зависимость константы диссоциации бинарных комплексов фермент - NADН.

Лактатдегидрогеназы: 1 - Н₄ быка; 2 - Н₄ свиньи; 3 - М₄ быка; М₄ — кролика; 6 — М₄ свиньи.

Рис. 3. иллюстрирует прямую пропорциональность К_дис от элюирующей концентрации NADН. Линейность указывает, что в данном случае константы диссоциации комплексов фермент - NADН играют более важную роль, чем константы диссоциации комплексов фермента с иммобилизованным аффинным лигандом (АМР). Таким образом, появилась возможность определения констант диссоциации двойных комплексов фермента с NADН; метод основан на установлении элюирующих концентраций NADН. Не обнаружено различий в величинах К_дис при использовании как кристаллических, так и неочищенных препаратов ферментов. Другие белки, присутствующие в неочищенных препаратах, даже если они связывались колонкой, не влияли на картину элюирования. Это обстоятельство создает огромное преимущество таких определений по сравнению с обычными методами определения констант диссоциации, которые требуют не только чистых ферментов, но также и гомогенных изоферментов. Другим преимуществом является большая быстрота и расход очень небольших количеств фермента для каждого определения.

Использование аффинной хроматографии для определения, например, констант ингибирования ферментов, по-видимому, весьма перспективно. Данные об объемах элюатов, содержащих фермент, на колонке с иммобилизованным ингибитором, полученные при использовании различных концентраций ингибитора в растворе, позволяют определить константы ингибирования как для связанного ингибитора, так и для ингибитора в растворе. Большое преимущество этого метода состоит в том, что при использовании одного и того же ингибитора как для иммобилизации, так и для элюирования можно непосредственно сделать выводы о влиянии связей с носителем и природы носителя на изучаемое взаимодействие на основании совпадения или различий в определяемых величинах констант диссоциации. Следовательно, метод аффинной хроматографии открывает новые возможности не только для изучения взаимодействия биологически активных веществ, он перспективен также и для выяснения влияния микроокружения на образование этих комплексов.

2. Примеры применения аффинной хроматографии

Области применения аффинной хроматографии расширяются, поскольку метод основан на специфических  взаимодействиях биологически активных веществ. Этот метод успешно используется при выделении самых разных соединений. Наряду с этим он полезен при изучении различных систем; на аффинных сорбентах  можно разделять низкомолекулярные  энантиомеры и удалять нежелательные  вещества из живых организмов. Например, аффинной хроматографией можно разделить  на оптические антиподы D, L-триптофан. Используя специфическое выделение меченых пептидов, можно определить пептиды активного центра фермента, связывающего участка антител или участка пептидных цепей на поверхности молекулы. Аффинная хроматография может быть использована для изучения возможности замены природных пептидных цепей ферментов различными модифицированными синтетическими пептидами. Активные центры ферментов или антител, связывающие свойства субъединиц, специфичность ферментов по отношению к различным ингибиторам, комплементарность нуклеиновых кислот, взаимодействие нуклеотидов с пептидами, влияние присутствия различных соединений на образование специфических комплексов и т. д. могут быть исследованы с помощью аффинной хроматографии.

Проблемы  механизма ферментативной активности могут быть изучены на основании  данных аффинной хроматографии. Такие  данные позволяют высказать суждение о молекулярных структурах, например, интерферонов фибробластов или лейкоцитов. Исследовались также возможности аффинной хроматографии для удаления нежелательных веществ из крови живых организмов.

Области применения аффинной хроматографии многочисленны  и разнообразны и не ограничиваются только теми, которые перечислены выше. В последующих разделах рассмотрены некоторые примеры, иллюстрирующие возможности аффинной хроматографии.

Колоночная  хроматография с использованием иммобилизованного бычьего сывороточного альбумина, присоединенного непосредственно к сефарозе 4В, сывороточного альбумина, присоединенного к сукциниламиноэтилагарозе, или обезжиренного сывороточного альбумина (по методу Чена, рис.4), присоединенного также к сукциниламиноэтилагарозе, привела к наилучшим результатам только в последнем случае.

Рис.4. Хроматография D, L-триптофана на препарате обезжиренный бычий сывороточный альбумин-cукциниламиноэтилагароза (250x9 мм).

D, L Триптофан (500 нмоль), растворенный в 0,1 мл 0,1 М боратного буфера (рН 9,2), содержащего 1 об. % диметилсульфоксида. наносился на колонку (содержащую 630 нмоль бычьего сывороточного альбумина). Колонка элюнровалась со скоростью 30 мл/ч боратным буфером (без диметилсульфоксида) (пробы отбирались в 20 пробирок), а затем 0,1 М уксусной кислотой. Свободный объем был определен по элюированию диметилсульфоксида.

Ход хроматографического  разделения иллюстрирует рис.4. Показано, что боратным буфером элюируется только D-триптофан, в то время как уксусной кислотой только L-триптофан. Аффинная хроматография, по-видимому, может быть применена для аналогичного разделения и других энантиомерных пар.

2.1 Полусинтетическая нуклеаза и комплементарное взаимодействие нуклеотидных фрагментов

Стафилококковая нуклеаза - фермент, исследованный с  помощью аффинной хроматографии наиболее широко. Успешное выделение нуклеазы на сефарозе с присоединенным 3-(4-аминофенилфосфорил)дезокситимидин-5'-фосфатом (pdТр-сефарозе) описано еще в 1968 г. Используя хроматографию триптического гидролизата нуклеазы, меченной (дезокситимидин-3',5'-дифосфатаминофенил) дезокситимидин-3-[¹⁴С]бромацетил-n-аминофенилфосфатом на сефарозе с присоединенной нуклеазой, Вилчек получил пептиды активного центра фермента.

Рис.5. Диаграмма линейной зависимости между аминокислотными последовательностями нуклеазы и ее фрагментами, которые дают продуктивную комплементарность. Рентгеноструктурными исследованиями были показаны β-структура между остатками 12 и 35 и три α-спиральных участка между остатками 55 и 67, 99 и 106, а также 122 и 133, которые отмечены на рисунке. Нуклеаза- (127-149) не связывается с нуклеазой-(1-126).

Проведя триптический гидролиз нуклеазы в присутствии  Са²⁺ и нуклеозид-3',5'-дезокситимидиндифосфата (рdТр), Онтьес и Анфинсен получили три фрагмента: пентапептид и два полипептидных фрагмента - нуклеаза-Т-(6-48) и нуклеаза-Т-(49-149) (рис.5). Последние (оба фрагмента) были неактивными и не имели упорядоченной структуры, будучи взятыми в отдельности, но они обратимо ассоциировали с образованием нековалентно связанного комплекса, названного нуклеазой-Т'. Нуклеаза-Т' обладает 8% (1620 ед./мкмоль) активности нативного фермента (15 800 ед./мкмоль), и ее трехмерная структура близка структуре нуклеазы. Такие же результаты были получены даже при замене нативного фрагмента нуклеаза-Т-(6-48) аналогичным пептидом, синтезированным по методу Меррифилда. Аффинная хроматография вновь оказалась весьма полезной и для очистки этого синтетического 42-членного пептида. Синтетический продукт очищался на сефарозе с присоединенным фрагментом нуклеаза-Т-(49-149). Прежде всего предварительно небольшие количества нативного фрагмента нуклеаза-Т-(6-48) хроматографировались на этой же колонке. Сорбция происходила при рН~8 в присутствии хлорида кальция и рdTр (необходимых для стабилизации комплекса). Нативный фрагмент затем элюировался разбавленной уксусной кислотой (рН~3), т. е. в условиях, когда комплекс диссоциирует. Согласно предварительным результатам, предложена следующая методика очистки синтетического фрагмента. На колонку (5x1 см) наносили 5 мг синтетического пептида в 0,05 М боратном буфере (рН~8), содержащем 0,01 моль/л хлорида кальция и 0,001 моль/л pdТр. При промывании исходным буфером элюировалось некоторое количество пептида, имеющего состав и подвижность при диск-электрофорезе нативного пептида-(6-48). Однако этот элюируемый пептид не сорбировался на колонке даже при повторной хроматографии. Около 7% общего количества нанесенного синтетического пептида элюировалось 0,001 М уксусной кислотой (рН~3). Эта часть не отличалась существенно по своему аминокислотному составу от исходного материала. Пептидный фрагмент, содержащийся в элюате, затем использовался для комплементарного комплексообразования с фрагментами нуклеаза-Т-(49-149) для полной замены нативного пептида. Таким образом была получена полусинтетическая нуклеаза.

Еще одним примером продуктивного комплементарного комплексообразования является комплекс двух других фрагментов той же нуклеазы, а именно комплекс, образованный нуклеазой-(1-126), приготовленной ограниченным триптическим гидролизом трифторацетилированной нуклеазы, и бромциановым фрагментом нуклеазы-(99-149). Этот комплекс обладает 10-12% ферментативной активности нативной нуклеазы. Оба упомянутые комплексы связывались с pdТр-сефарозой.

На  pdTр-сефарозе была связана смесь трех фрагментов: 0,085 мкмоль нуклеазы-Т-(6-48), 0,060 мкмоль нуклеазы-Т-(49, 50-126) [нуклеаза-Т-(49, 50-126) представляет собой смесь пептидов - нуклеазы-Т-(49-126) и нуклеазы-Т-(50-126)], 0,067 мкмоль нуклеазы-(99-149) в присутствии 0,01 моль/л хлорида кальция в 0,2 мл 0,1 М ацетата аммония (рН~8) при 4, 10, 15 и 20 °С наносились на колонку (4x1 см) с рdТр-сефарозой. Количество комплекса, элюируемого 0,1 М уксусной кислотой, сильно зависит от температуры; оно максимально при 4°С и снижается с повышением температуры. На основании аминокислотного анализа и двумерных пептидных карт триптического гидролизата показано, что элюируемый комплекс состоит из эквимолярных количеств нуклеазы-Т-(6-48), нуклеазы-Т-(49, 50-126) и нуклеазы-(99-149). Удельная активность комплекса 15,3 ед./мкмоль. Уменьшение сорбции комплекса, наблюдаемое при росте температуры, может объясняться ухудшением комплексобразования или снижением сродства аффинного лиганда к комплексу, которое обусловлено термической неустойчивостью ферментативной активности трехфрагментного комплекса. При аффинной хроматографии любой комбинации двух из трех упомянутых выше фрагментов не происходит существенной сорбции даже при 4°С. При этой температуре не наблюдалась также сорбция трех фрагментов в отсутствие хлорида кальция или при нанесении смеси фрагментов нуклеазы-(1-120) и нуклеазы-(127-149).

Эти результаты показывают, что аффинная хроматография  может стать также важным методом изучения комплементарного образования комплексов пептидных фрагментов активных белков, приготовленных путем выделения из природного материала или синтетически.