Использование аффинной хромотографии для оценки качества полимеров на основе природного сырья

Министерство  образования и науки Российской федерации

Федеральное государственное бюджетное образовательное  учреждение высшего профессионального  образования

Омский государственный  технический университет

Кафедра: «Биотехнология»

 

 

 

 

 

 

 

Домашняя  работа по теме:

«Использование  аффинной хромотографии для оценки качества полимеров на основе природного сырья»

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Омск 2012

Содержание:

Введение…………………………………………………………………..3

1.Принцип  метода аффинной хроматографии,  историческая справка и применение………………………………………………………………………4

2.Примеры  применения аффинной хроматографии…………………..10

2.1.Полусинтетическая нуклеаза и комплементарное взаимодействие нуклеотидных фрагментов…………………………12

Список  используемой литературы…………………………………..16 
Введение

 

Макромолекулы, такие, как белки, полисахариды и нуклеиновые кислоты, внутри своих индивидуальных групп отличаются по физико-химическим свойствам лишь незначительно; поэтому их выделение, основанное на различиях в этих свойствах, например, с помощью ионообменной хроматографии, гель-фильтрации или электрофореза сопряжено с известными трудностями и требует много времени. Вследствие этого в ходе выделения существенно падает их активность из-за денатурации, расщепления, ферментативного гидролиза и т. п. Одним из наиболее характерных свойств этих биологических макромолекул является их способность обратимо связывать другие вещества. Например, ферменты образуют комплексы с субстратами или ингибиторами, антитела - с антигенами, а нуклеиновые кислоты, такие, как информационная РНК, гибридизуются с комплементарными ДНК и т. д. Образование специфических диссоциирующих комплексов биологических макромолекул служит основой метода их очистки, известного как аффинная хроматография.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1. Принцип метода аффинной хроматографии, историческая справка и применение

 

Аффинная  хроматография (или, более точно, биоаффинная  или биоспецифическая по сродству хроматография) основана на исключительной способности  биологически активных веществ связывать  специфически и обратимо другие вещества, называемые в общем случае лигандами  или аффинными лигандами, или  упрощенно аффинантами.

Если приготовить нерастворимый аффинант (обычно это делают путем ковалентной привязки к нерастворимой подложке) и раствор, содержащий биологически активные продукты, которые необходимо выделить, пропустить через колонку с этим аффинантом, то все соединения, которые в данных условиях эксперимента не обладают сродством к аффинанту, будут проходить не задерживаясь, а продукты, обнаруживающие сродство к нерастворимому аффинному лиганду, будут сорбироваться на колонке. Последние могут быть освобождены далее из комплекса с иммобилизованным лигандом, например, с помощью раствора растворимого аффинанта или путем изменения состава растворителя. Диссоциация комплекса часто может быть достигнута изменением рН, ионной силы или температуры либо с помощью специфических агентов, как это будет показано далее. Согласно О'Карра и др, следует различать биоспецифическую десорбцию и небио- специфическую десорбцию с помощью так называемых «деформирующих буферов», как показано схематически на рис.

Рис.1. Схема биоспецифической адсорбции (Л), элюирования «деформирующим» буферным раствором (Б) и биоэлгоирования растворимым конкурентным лигандом (В).

 Инг — иммобилизованный ингибитор; L — конкурентный лиганд.

 

Аффинная хроматография  как метод, по-видимому, впервые была применена Штаркенштайном в 1910 г. для выделения α-амилазы с помощью нерастворимого субстрата (крахмала). Принцип аффинной хроматографии, использующий аффинанты, ковалентно связанные с нерастворимой матрицей, известен более 20 лет. Кемпбелл и др, были, вероятно, первыми (1951 г.), в чьих работах этот принцип получил практическое приложение для выделения антител на колонке с целлюлозой с ковалентно присоединенным антигеном. Для выделения ферментов аффинная хроматография впервые была применена в 1953 г. Лерманом, который выделил тирозиназу на колонке с целлюлозой, эфирно связанной с остатками резорцина. В последующие годы аффинная хроматография использовалась весьма редко, что очевидно, обусловлено свойствами известных в то время нерастворимых подложек, которые ограничивали возможности образования комплексов между выделяемыми продуктами и присоединенными аффинантами. На подложках с гидрофобными или ионогенными группами часто наблюдалась неспецифическая сорбция.

Однако  наблюдается широкое развитие метода. Толчком послужило открытие Поратом  присоединения аффинанта к агарозе, активированной бромцианом.

        Куатреказас и Анфинсек показали, что агароза (наиболее распространенная продажная форма сефарозы) обладает почти всеми характеристиками идеального носителя. В 1968 г. Куатреказас и др. успешно применили аффинную хроматографию для выделения нуклеазы, химотрипсина и карбоксипептидазы А и предложили термин «аффинная хроматография». Далее развитие метода шло в основном в направлении его применения для выделения ферментов, их ингибиторов, антител и антигенов, нуклеиновых кислот, транспортных и репрессорных белков, гормонов и их рецепторов и др.

Использование аффинной хроматографии тем не менее  не ограничивается только выделением биологически активных веществ. Уже  в 1960 г. Яги и др. описали определение  небольших количеств антител  с помощью нерастворимых носителей  с привязанными антигенами. Иммобилизованные олигомеры политимидиловой кислоты использовали Эдмондс и др. для количественного определения полиадениловой кислоты. Аффинная гель-фильтрация как микрометод при экспрессных определениях молекулярных масс дегидрогеназ основана на исключении последних из гелевой среды с варьируемым размером пор; метод описан Лоу и Дином.

По своей сути аффинная хроматография - идеальный метод  для изучения взаимодействий в биохимических  процессах. Иммобилизованная лейцил-тРНК-синтетаза  использована как для выделения  изолейцил-тРНК, так и для изучения взаимодействия белка с нуклеиновой  кислотой. Взаимодействия пептидов с  белками и нуклеотидов с аминокислотами и пептидами также изучены этим методом.

Рис.2. Элюирование изоферментов лактатдегидрогеназы вогнутым градиентом NАDН.

0,2 мл образца белка  (0,2 мг) в растворе, содержащем 0.1 М  Na-фoсфатный буфер (рН~7.0), 1 мМ β-меркаптоэтанол и 1 М хлорид натрия, нанесены на колонку зой со связанным аналогом АМР <140x8 мм, содержащую 2,5 г влажного геля), уравновешенную 0.1 М Nа-фосфатным буфером (рН~7,5); затем колонка промыта 10 мл используемого буферного раствора, изоферменты элюированы вогнутым градиентом NADН (от 0,0 до 0.3 ммоль/л) в буферном растворе 1 мМ β-меркаптоэтанола. Объем фракция 1 мл; скорость потока 3,4 мл/ч.

 

Кроме того, метод применен для исследования механизмов ферментативных процессов и выяснения структур молекул. Аканума и др применили его для изучения связывающего участка бычьей карбоксипептидазы В, исследуя комплексообразование с иммобилизованными субстратными аналогами основных и ароматических аминокислот. Используя аффинную хроматографию, Дилени и О'Карра показали, что оксалоацетат ингибирует лактатдегидрогеназу путем образования тройного непродуктивного комплекса с комплексом фермент – NAD⁺, а не с комплексом фермент - NАDН, как предполагалось первоначально. Аффинная хроматография оказалась весьма полезной при изучении кинетики активации трипсиногена. Молекулярная структура интерферонов фибробластов и лейкоцитов человека изучена с помощью аффинной хроматографии Янковским и др.