Ферменты для молекулярной биологии и генетической инженерии

Ферменты, используемые в молекулярном клонировании  

Рестрикционные эндонуклеазы. Основные принципы организации систем рестрикции–модификации у бактерий. Роль систем рестрикции – модификации в регуляции переноса генетической информации между бактериями. Классификация и номенклатура рестриктаз. Изошизомеры. Крупно- и мелкощепящие рестриктазы. Фрагменты с выступающими 3’- , 5’- и тупыми концами. Встречаемость тетра- и гексануклеотидов в ДНК. Лигирование фрагментов ДНК с липкими концами, образуемыми разными рестриктазами. Гибридные сайты.  

Единица активности рестриктазы. Определение количества фермента, необходимого для гидролиза ДНК определенного размера и с известным числом рестрикционных сайтов. Активность рестриктазы и свойства субстрата (длина и состав оснований фланкирующих последовательностей, расположение сайтов узнавания по отношению друг к другу, структура ДНК). Специфичность рестриктаз. Снижение специфичности рестриктаз (“star-activity” - активность со звездочкой) и обуславливающие ее факторы. 

Определение размеров рестрикционных фрагментов с помощью электрофореза в агарозных и полиакриламидных гелях. Конформационные формы молекул ДНК. Маркеры размеров ДНК. 

Использование рестриктаз для конструирования рекомбинантных молекул in vitro. Сайты рестрикции как генетические маркеры. Использование рестриктаз для физического картирования, анализа полиморфизма ДНК, штаммоспецифической характеристики вирусов и бактерий, идентификации плазмид. Использование сайтов рестрикции в качестве точек отсчета при секвенировании. 

ДНК- и РНК-лигазы фага Т4. 

ДНК-полимеразы из различных источников; их свойства и применение. 

ДНК-полимераза I из E.coli. Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I. ДНК-полимераза фага Т4. Термостабильные ДНК-полимеразы. Обратные транскриптазы (РНК-зависимые ДНК-полимеразы). 

РНК-полимеразы. РНК-полимеразы фагов T3, T7, SP6. 

Поли (А)-полимеразы. 

Дезоксирибонуклеазы. Дезоксирибонуклеаза I (панкреатическая дезоксирибонуклеаза). Нуклеаза Bal31. Нуклеаза S1. Нуклеаза из проростков золотистой фасоли. Экзонуклеазы III и VII. Экзонуклеаза фага λ.  

Рибонуклеазы. Рибонуклеазы А и Т1. Рибонуклеаза H. 

Другие  ферменты. Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфе-раза. Полинуклеотидкиназа фага Т4. Терминаза фага λ. Щелочные фосфатазы. Топоизомеразы. 

Компания  Novagen специализируется на  производстве высокоточных полимераз и наборов для ПЦР. 

Самым простым и доступным продуктом (для диагностических целей) является  NovaTaq™ Hot Start ДНК полимераза. Это химически модифицированная форма Taq ДНК полимеразы, неактивная при комнатной температуре и активируемая тепловой обработкой при 95°C в течение 7-10 минут (см. инструкцию). Фермент обеспечивает лучшую специфичность при сравнении со стандартной Taq ДНК полимеразой и может минимизировать образование неспецифичных продуктов амплификации, таких как димеры и межпраймерные образования. Фермент дает ПЦР продукты с 3′-dA липкими концами, подходящими для клонирования с наборами Perfectly Blunt®, AccepTor™ и LIC Vector. 

Преимущества: 

• Хорошая  специфичность и выход ПЦР  продукта

• Наиболее точная амплификация низкокопийных фрагментов до 5 kbp

• Идеальна для качественных и высокопроизводительных методов ПЦР 

KOD HiFi ДНК полимераза – это высокоточная термостабильная полимераза, амплифицирующая ДНК последовательности до 6 kbp с безупречной точностью и максимальным выходом продукта. Ферментная 3′→5′ экзонуклеазнозависимая proofreading активность приводит к более низкой частоте мутаций в ходе ПЦР, чем у других коммерчески доступных ДНК полимераз. Скорость наращивания и процессивность в 5 и в 10 - 15 раз выше соответственно, чем у Pfu ДНК полимеразы. Этот фермент позволяет получить продукты с тупыми концами, подходящие для дальнейшего клонирования с наборами Novagen Perfectly Blunt® и LIC Vector. KOD HiFi ДНК полимеразы доступны также в версии hot start для большей специфичности и длины считывания. Также доступна в качестве смеси с мутантной формы KOD HiFi, кот. лишена  3′→5′ экзонуклеазной активности. Так называемая KOD XL ДНК полимераза рекомендуется для очень длинных последовательностей 

Преимущества:

Более точный ПЦР за более короткое время

Лучшая  воспроизводимость чем у Pfu DNA полимеразы – превосходна для клонирования

Великолепный  выход—скорость наращивания в 2 раза быстрее, чем у Taq ДНК полимеразы и в 5 раз, чем у Pfu ДНК полимеразы

Более высокая процессивность—последовательная полимеризация нуклеотидов в  10-15-раз выше, чем у Pfu и Taq ДНК полимераз

Отсутствие  искаженных продуктов амплификации  

KOD Hot Start ДНК полимераза - это комплекс KOD HiFi ДНК полимеразы и двух моноклональных антител, ингибирующих ДНК полимеразную и 3′→5′ экзонуклеазную активность при комнатной температуре (Mizuguchi 1999). KOD Hot Start сочетает высокую точность, высокую скорость наращивания и выдающуюся процессивность KOD HiFi с высокой специфичностью hot start, обусловленную участием антител. Неспецифическая амплификация еще меньше из-за отсутствия межпраймерных взаимодействий, обычно происходящих в результате установления и роста температуры. Кроме этого, праймеры разрушаются в процессе установки комнатной температуры благодаря эффективно ингибируемой экзонуклеазной активности. KOD Hot Start ДНК полимераза образует ПЦР продукты с тупыми концами для клонирования с наборами Novagen Perfectly Blunt® и LIC Vector. 

Преимущества:

Быстрая скорость элонгации

Высокая специфичность и выход продукта

Длинное считывание - более 15 kb ДНК

Успешная  амплификация трудных участков (содержание GC> 70%)

Улучшенная  амплификация низкокопийной целевой ДНК  

KOD XL ДНК  полимераза - это оптимизированная  смесь KOD HiFi ДНК полимеразы и мутантной формы KOD HiFi, кот. лишена  3′→5′ экзонуклеазной активности (Nishioka 2002). Эта смесь ферментов разработана для надежной амплификации длинных, сложных последовательностей с обильным выходом и высокой точностью. Она также может использоваться для включения производных dNTPs в ПЦР ампликоны (Sawai 2002, Sawai 2001). KOD XL ДНК полимераза образует смесь ПЦР продуктов с тупыми и липкими 3′-dA концами, подходящими для клонирования с наборами Novagen Perfectly Blunt®, AccepTor™, и LIC Vector. 

Преимущества:

Идеальна для амплификации больших фрагментов DNA из очищенных и необработанных образцов

Амплификация  последовательностей до более чем 30 kbp

Успешная  амплификация GC-обогащенных последовательностей 

Эффективно  включает производные dNTPs

Открытие  термостабильной ДНК-полимеразы (Taq-полимеразы) из термофильных бактерий Thermis aquaticus , оптимум работы которой находится в области 70-72°С, позволило сделать процесс репликации ДНК циклическим и использовать его для работы. Создание программируемых термостатов (амплификаторов), которые по заданной программе осуществляют циклическую смену температур, создало предпосылки для широкого внедрения метода ПЦР в практику лабораторной клинической диагностики. При многократном повторении циклов синтеза происходит экспоненциальное увеличение числа копий специфического фрагмента ДНК, что позволяет из небольшого количества анализируемого материала, который может содержать единичные клетки микроорганизмов получить достаточное количество ДНК копий для идентификации их методом электрофореза.

РНК-полимераза

Фермент, осуществляющий матричный синтез РНК  из рибонуклеозидтрифосфатов; в зависимости от используемой матрицы - ДНК или РНК - различают ДНК-зависимую и РНК-зависимую РНК-п.; у прокариот имеется 2 типа РНК-п.: одна из них синтезирует РНК-затравки для фрагментов Оказаки, а другая - все остальные типы РНК; у эукариот - 3 типа РНК-п.: РНК-п.I осуществляет синтез рРНК, РНК-п.II синтезирует мРНК, а РНК-п.III - тРНК, 5S-РНК и др. небольшие РНК; активность РНК-п. может полностью подавляться некоторыми антибиотиками - например, рифамицином и актиномицином D (бактериальная РНК-п.), альфа-аманитином (РНК-п.II прокариот).

РНК-полимераза фага SP6

ДНК-зависимая РНК-полимераза бактериофага SP6 (поражает сальмонеллу Salmonella typhimurium), высокоспецифичная в отношении SP6-промоторов; широко используется для синтеза in vitro РНК на матрице, находящейся под контролем этих промоторов, такие транскрипты обычно называют SP6 run-off.