Ферменты для молекулярной биологии и генетической инженерии

Ферменты  для молекулярной биологии и генетической инженерии 

Тема: Биотехнология  Дата:  24.5.06  

К числу  таких ферментов относятся ДНК– и РНК-полимеразы, обратные транскриптазы, ДНК-метилтрансферазы, эндонуклеазы рестрикции, ферменты репарации, ДНК-лигазы и т.д.

Значительные  достижения последних лет в области  молекулярной биологии и генной инженерии  во многом связаны с успешным использованием ферментов нуклеотидного обмена.  
 

К числу  таких ферментов относятся ДНК– и РНК-полимеразы, обратные транскриптазы, обеспечивающие воспроизведение молекул нуклеиновых кислот в клетке; ДНК-метилтрансферазы, ответственные за присоединение к ДНК метильных групп; эндонуклеазы рестрикции, способные узнавать специфические последовательности нуклеотидов в ДНК и разрезать ДНК в определенных местах; ферменты репарации, исправляющие ошибки (мутации) в ДНК, ДНК-лигазы, сшивающие нити ДНК и т.д. 

Из большого арсенала методов анализа ДНК  полимеразная цепная реакция (ПЦР), основанная на циклической репликации матрицы (реакцию проводят, циклически поднимая и понижая температуру, обычно в пределах от 40–55 до 95°C), наиболее широко применяется в генно-инженерной практике и клинической диагностике. В основе современной методологии ПЦР лежит использование термостабильной ДНК-полимеразы из термофильной бактерии Thermus aquaticus (Taq-ДНК-полимеразы). Температурный оптимум ферментативной активности Taq-ДНК-полимеразы составляет 70–72°С, фермент сохраняет активность и при 95°C. Taq-ДНК-полимераза состоит из двух глобулярных пространственно разделенных доменов: полимеризационного, осуществляющего встраивание нуклеотидов в растущую цепь ДНК, и домена, обладающего 5’–3’-экзонуклеазной активностью. Благодаря 5’–3’-экзонуклеазной активности Taq-ДНК-полимераза расщепляет небольшие фрагменты ДНК, присоединенные к цепи ДНК, которая используется в качестве матрицы при полимеризации. Такое свойство фермента нашло применение в количественных методиках ПЦР для разрушения флуоресцентных зондов. 

Однако  с точки зрения современных требований, предъявляемых к полимеразам, Taq-ДНК-полимераза обладает рядом недостатков. Фермент  допускает ошибки при полимеризации  ДНК, не способен к синтезу достаточно протяженных фрагментов НК, не обладает корректирующей (3’–5’-экзонуклеазной) активностью, недостаточно термостабилен, имеет невысокую скорость полимеризации и процессивность. 5’–3’-экзонуклеазная активность Taq-ДНК-полимеразы не удовлетворяет требованиям современных методов анализа ДНК. Нативный фермент не может использовать РНК в качестве матрицы. 

Ряд отмеченных проблем можно снять, применяя в  ПЦР ДНК-полимеразы из гипертермофильных архейных микроорганизмов, способных существовать при температурах, близких к температуре кипения. Например, фермент из микроорганизма Pyrococcus furiosus обладает более высокой термостабильностью и точностью при синтезе ДНК, способен обеспечивать синтез протяженных фрагментов НК. Такие свойства фермента являются следствием наличия у него 3’–5’-корректирующей нуклеазной активности. Среди недостатков Pfu-ДНК-полимеразы следует отметить относительно низкую эффективность полимеризации, более низкую по сравнению с Taq-ДНК-полимеразой скорость полимеризации, отсутствие способности к синтезу ДНК на матрице РНК. 

Таким образом, фермент со свойствами, оптимальными для ПЦР, в природе пока не обнаружен. Создание эффективной ДНК/РНК полимеразы – актуальная задача сегодняшнего дня. 

Создание  эффективной ДНК/РНК полимеразы 
 

Ученые  из лаборатории генетической регуляции  биохимических процессов НИИ  эпидемиологии и микробиологии  им. Н.Ф. Гамалеи РАМН под руководством кандидата биологических наук Владимира Лунина имеют существенный опыт в области создания продуцентов ферментов для молекулярной биологии и генетической инженерии. Группой исследователей проклонированы гены и созданы эффективные продуценты следующих ферментов нуклеотидного обмена: Thermus aquaticus ДНК полимеразы, Thermus thermophilus ДНК полимеразы/ревертазы, Klenow фрагмента ДНК полимеразы I E. coli, M-MLV ревертазы (Moloney), Thermus thermophilus неорганической пирофосфатазы (PPi), Thermus thermophilus ДНК лигазы, E. coli ДНК-лигазы, T4 ДНК-лигазы, Thermus thermophilus РНКазы H, E. coli РНКазы H, T4-полинуклеотид киназы, урацил-ДНК-гликозилазы E. сoli (UDG), Thermus aquaticus структуроспецифической эндонуклеазы (5’–3’-экзонуклеазы). 

С помощью  методов генной и белковой инженерии  ученые получили модифицированные производные  и разработали технологии получения  полимераз второго поколения: Thermus aquaticus ДНК-полимеразы без ДНК E. сoli, Thermus aquaticus ДНК-полимеразы без ДНК E. coli и Homo sapiens, химически модифицированной Taq-ДНК-полимеразы (Thermostar ДНК полимеразы) со встроенным «горячим стартом», Taq-ДНК-полимеразы в комплексе с моноклональными антителами, также обеспечивающими «горячий старт», генетически модифицированной Taq -ДНК-полимеразы для секвенирования ДНК. 

Препараты ферментов имеют низкую себестоимость  и ориентированы на массовое применение. По своим качественным характеристикам  они соответствуют мировому уровню и широко используются в генно-инженерной и молекулярно-биологической практике в России. 

Из оригинальных ферментов и реагентов для  генетической инженерии учеными  лаборатории проклонированы гены и созданы следующие препараты: ДНК-полимераза из Archaeoglobus fulgidus – гипертермофильного архейного микроорганизма (данный фермент лишь на 37% гомологичен Pfu-ДНК-полимеразе); АТФ-зависимая ДНК-лигаза из Archaeoglobus fulgidus; активатор Taq-ДНК-полимеразы – неспецифический ДНК-связывающийся белок, повышающий точность и эффективность работы Taq-ДНК-полимеразы; NС-белок вируса лейкемии кошек – неспецифически ДНК/РНК-связывающий белок, повышающий эффективность работы M-MLV ревертазы; фрагмент тяжелой цепи моноклонального антитела к Taq-ДНК-полимеразе; Hot Start Compound (HS) – химически синтезированный олигонуклеотид, образующий комплекс с Taq-ДНК-полимеразой и ингибирующий ее активность при низкой температуре. 

Получение ферментов нуклеотидного обмена с улучшенными характеристиками  
 

В настоящее  время в лаборатории планируется  создать новые ферменты с улучшенными  свойствами для целей амплификации и модификации нуклеиновых кислот и провести масштабирование процессов  их выделения и очистки. 

Стандартным подходом для улучшения свойств  полимераз стало получение химерных белков, в которых к полимеразному домену присоединен неспецифический ДНК-связывающийся домен. Химерные полимеразы будут иметь улучшенные характеристики в точности и скорости синтеза, процессивности, продуктивности, способности к синтезу протяженных фрагментов и устойчивости к высоким концентрациям солей. В соответствии с этой идеологией исследователи из лаборатории генетической регуляции биохимических процессов НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН работают над созданием химерных полимераз (традиционных из Thermus aquaticus, Pyrococcus furiosus и оригинальных из Thermotoga neapolitana, Archaeoglobus fulgidus) с описанным в литературе ДНК-связывающим доменом Sso7d и проклонированным авторами из Thermus aquaticus термостабильным неспецифическим ДНК-связывающим доменом. Разрабатывается химерная M-MLV ревертаза с неспецифически ДНК/РНК-связывающим NC белком вируса лейкемии кошек; химерные 5’–3’-экзонуклеазы (структуроспецифические эндонуклеазы) (традиционные из Thermus aquaticus, Pyrococcus furiosus и оригинальные из Thermotoga neapolitana и Archaeo-globus fulgidus) с термостабильными неспецифическими доменами, связывающими двухцепочечную ДНК. 

Создание  улучшенных вариантов ДНК полимераз  с «горячим стартом»  
 

Исследователи под руководством Владимира Лунина проклонировали фрагмент моноклонального однодоменного антитела к Taq-ДНК-полимеразе, получили его эффективный бактериальный продуцент и в настоящий момент изучают ингибирующие свойства однодоменного антитела. На основе полученных данных будет создан препарат Taq-ДНК-полимеразы с однодоменным антителом, образующим комплекс с ферментом и, таким образом, обеспечивающим «горячий старт» ПЦР. 

Системы, предотвращающие контаминацию, с  использованием урацил-ДНК-гликозилаз  
 

Высокая чувствительность метода ПЦР обусловливает  и основную проблему применения самого метода – контаминацию (загрязнение  лабораторного помещения продуктами ПЦР). В основе ПЦР-контаминации лежит попадание из внешней среды в реакционную смесь специфических и неспецифических молекул ДНК, способных служить мишенями в реакции амплификации и давать ложноположительные результаты. Одним из основных способов борьбы с контаминацией является использование в реакционной смеси вместо одного из нуклеозидтрифосфатов – дезокситимидинтрифосфата (dTTP), неканонического, характерного для РНК, дезоксиуридинтрифосфата (dUTP). В результате получаемые фрагменты ДНК оказываются «мечеными» дезоксиурацилом. Специальный термолабильный фермент – урацил-ДНК-гликозилаза (UDG) используется для пред-обработки реакционной смеси перед проведением ПЦР. UDG выщепляет дезоксиурацил из ДНК и делает непригодными для полимеразной реакции случайно попавшие в пробирку контаминирующие фрагменты. В то же время природная матрица не содержит дезоксиурацила и с нее начинает нарабатываться специфический продукт (в свою очередь, меченый дезоксиурацилом). Специфический продукт во время реакции остается интактным и не расщепляется UDG, поскольку присутствующий в пробирке термолабильный фермент инактивируется в первые же минуты при нагревании реакционной смеси до 95°С. Данная технология реализована в нескольких полученных учеными универсальных ПЦР-наборах с урацил-ДНК-гликозилазой, дезоксиурацил-трифосфатом и разными вариантами ДНК-полимераз со встроенным «горячим стартом». 

Свойства  созданных ферментов и характеристики исследовательских наборов будут  испытаны в различных методиках, применяемых в молекулярно-биологической  и генно-инженерной практике в институте  молекулярной генетики РАН, НИИ эпидемиологии  и микробиологии им Н.Ф. Гамалея РАМН. Разработанные на основе новых ферментов ПЦР-наборы пройдут проверку при тестировании патогенных и генетически модифицированных микроорганизмов в НИИЭМ им Н.Ф. Гамалея РАМН и при выявлении генетически модифицированных растений в Институте питания РАМН.

ДНК-зависимые  ДНК-полимеразы в генной инженерии 

Среди ДНК-зависимых ДНК-полимераз наибольшее применение в генной инженерии находят  ДНК-полимераза I E. coli и ее большой фрагмент ( фрагмент Кленова ), Т4-ДНК-полимераза и термостабильные ДНК-полимеразы, особенно ДНК-полимераза Thermus aquaticus ( Taq-полимераза ). Все эти ферменты в присутствии ионов Mg2+ из четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и TTP) осуществляют синтез ДНК, комплементарной матричной ДНК, и для функционирования требуют наличия затравки на одноцепочечной матричной ДНК, т.е. олиго- или полидезоксирибонуклеотида со свободным 3'-ОН-концом, комплементарного матричной ДНК.

ДНК-полимераза I E. coli: роль в синтезе ДНК и РНК 

ДНК-полимераза I E. coli состоит из одной полипептидной цепи с молекулярной массой около 109 кДа и обладает тремя активностями: полимеризующей в направлении 5'->3', 5'->3'- экзонуклеазной и 3'->5'-экзонуклеазной. Большой фрагмент ДНК- полимеразы I E. coli ( фрагмент Кленова ) является частью полипептидной цепи ДНК-полимеразы I с молекулярной массой около 76 кДа, у которой отсутствует домен, соответствующий 5'->3'- экзонуклеазе. Как ДНК-полимераза I, так и ее фрагмент используются для введения радиоактивно меченных дезоксирибонуклеотидов в синтезируемые цепи ДНК путем ник- трансляции, т.е. перемещения одноцепочечного разрыва вдоль молекулы двухцепочечной ДНК, в котором 3'-ОН-конец используется в качестве затравки для ферментов. При этом ДНК-полимераза I прокладывает себе путь с помощью 5'->3'-экзонуклеазы, а фрагмент Кленова вытесняет цепь ДНК с 5'-конца. Кроме того, фрагмент Кленова используют для синтеза второй цепи кДНК, секвенирования ДНК по методу Сенгера, заполнения 5'-выступающих "липких" концов ДНК с образованием "тупых" концов, введения концевой радиоактивной метки, а также для удаления 3'-выступающих концов рестрикционных фрагментов ДНК 3'->5'-экзонуклеазой этого фермента. 

ТЕРМОСТАБИЛЬНАЯ ДНК-ПОЛИМЕРАЗА, СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ, ФРАГМЕНТ ВЫДЕЛЕННОЙ ДНК, СПОСОБ АМПЛИФИКАЦИИ ДНК, СПОСОБ ВВЕДЕНИЯ МЕТКИ В ДНК И  СПОСОБ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ

Патент  Российской Федерации 

Суть  изобретения: Изобретение относится к биотехнологии. ДНК-полимераза получена из термофильной эубактерии Carboxydothermus hydrogenoformans или Е. coli BL21 (DE3) pUBS520pAR4 DSM 11179. ДНК-полимераза проявляет зависимую от ионов магния обратнотранскриптазную активность и 3'-5'-экзонуклеазную активность, имеет кажущуюся молекулярную массу около 100-105 кДа. Изобретение включает также рекомбинантные плазмиды и трансформированные клетки-хозяева, способные продуцировать фермент. Фрагмент выделенной ДНК с нуклеотидной последовательностью, приведенной в описании, кодирует термостабильную ДНК-полимеразу. Фрагмент ДНК получают из Carboxydothermus hydrogenoformans. Культивируют природный штамм Carboxydothermus hydrogenoformans или Е. coli BL21 (DE3) pUBS520pAR4 DSM 11179. Клетки штамма суспендируют в буфере, разрушают клетки. Очищают выделенную ДНК-полимеразу методом хроматографии. При амплификации, введении метки и проведении обратной транскрипции используют термостабильную ДНК-полимеразу. Изобретение обеспечивает получение ДНК-полимеразы, активной при более высоких температурах, обладающей 3'-5'-полимеразной активностью и обратнотранскриптазной активностью в присутствии ионов магния и отсутствии ионов марганца. 6 с. и 2 з.п. ф-лы, 12 ил.