МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РФ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

Кафедра эпизоотологии и терапии

ДОКЛАД

по дисциплине «Микробиология»

на тему: «Характеристика возбудителя лептоспироза»

Выполнил: студент 3 года обучения

                         ф-та «Биотехнологии и вет. медицины»

Содержание:

Введение

1 Краткая характеристика болезни

2 Характеристика возбудителя

2. 1 Материал для исследования

2. 2 Морфология

2. 3 Культуральные свойства микроорганизма

2. 4 Биохимические свойства

2. 5 Токсинообразовние

2. 6 Антигенная структура

2. 7 Устойчивость

3 Биопрепараты и иммунитет

Заключение

Список литературы

Введение

Лептоспироз — инфекционная природно-очаговая болезнь жи­вотных и человека, характеризующаяся кратковременной лихо­радкой, анемией, желтухой, гемоглобинурией, геморрагическим диатезом, некрозом слизистых оболочек и кожи, атонией органов пищеварения, абортами. Болезнь может протекать бессимптомно.

Впервые болезнь описали в Германии Weil (1886) и в России Н. П. Васильев (1888). Возбудителя болезни открыли в Японии в 1914 г. Им удалось изолировать спирохет из печени морских свинок, заражен­ных кровью больных «инфекционной желтухой» людей. В 1935 г. С. Н. Никольский описал на Северном Кавказе остропротекающую болезнь крупного рогатого скота, названную иктерогемоглобинурией. Роль лептоспир в этиологии иктерогемоглобинурии доказали В. И. Терских (1939) и М. В. Земсков (1940).

По актуальности, эпидемиологической значимости и экономическому ущербу лептоспироз стоит в одном ряду с туберкулезом и бруцеллезом впереди пастереллеза, сибирской язвы, листериоза, эмфизематозного карбункула и др.

1. Краткая характеристика болезни

Патогенность. К лептоспирозу наиболее восприимчивы круп­ный рогатый скот (серогруппы L. Pomona и L. Hebdomadis), свиньи (серогруппы L.Pomona и L. Tarassovi), овцы, лисицы, песцы, ме­нее—лошади, козы, буйволы, верблюды, олени, ослы, собаки, кошки, куры. Болеет и человек. Основные носители лептоспир в природных очагах: серые и водяные полевки, ондатры, серые кры­сы, домовые мыши, землеройки.

К экспериментальному заражению наиболее чувствительны зо­лотистые хомяки, крольчата-сосуны и молодые морские свинки.

Эпидемиология. Лептоспироз — широко распространенный зооноз, встречается во всех частях света. Существуют природные очаги лептоспироза — преимущественно в лесах, заболоченных местностях, реках. Источником инфекции в них являются дикие животные — грызуны, лисы, песцы и др. Моча животных попа­дает в воду, загрязняет почву, растительность. Заболеваемость ха­рактеризуется строгой сезонностью (июнь-сентябрь) и связа­на с сельскохозяйственными работами (покос лугов, уборка сена), а также сбором грибов, ягод, охотой, рыбалкой. В сельс­кой местности источником инфекции могут быть домашние животные: свиньи, крупный рогатый скот, собаки. Заражение может происходить пищевым путем, например при употребле­нии молока. Возможен также контактно-бытовой путь передачи — при уходе за больными животными. Однако основной путь пе­редачи инфекции — водный. Нередко в сельской местности при купании людей в загрязненных мочой больных животных водо­емах возникают «купальные» вспышки. Возможны случаи лептос­пироза также в портовых городах, где много крыс.[3]

Патогенез. Входными воротами возбудителя являются повреж­денные кожа и слизистые оболочки (парезы, ссадины). Патогенные лептоспиры благодаря активной подвижности преодолевают защитные барьеры организма и быстро проникают в кровь. Через 12 ч после зараже­ния их обнаруживают в печени. Затем наступает генерализация инфекции (бактеремия), размножение и накопление лептоспир в печени, почках, надпочечниках, селезенке, легких, появляется ли­хорадка. К этому времени образуются антитела. Они инактивиру­ют лептоспиры, и происходит их элиминация из крови и паренхи­матозных органов. В почечных же клубочках и канальцах лептос­пиры недоступны воздействию антител, где они активно размно­жаются и выделяются с мочой.[8]

Лизис лептоспир сопровождается накоплением токсических веществ, под действием которых повышается проницаемость со­судов, лизируются эритроциты, происходят кровоизлияния, раз­виваются гематурия и желтуха, поражается нервная система. Ток­сикоз может привести к гибели животного.

Клиническая картина. Инкубационный период обычно продол­жается 7-10 дней, заболевание — 5-6 нед. Болезнь, как пра­вило, начинается остро, температура тела повышается до 39-40˚С, появляются головная боль, резкие боли в мышцах, осо­бенно в икроножных. В зависимости от поражения тех или иных органов появляются симптомы их повреждения: почечная недо­статочность, желтуха и др. Характерна волнообразная лихорадка. Клинические формы лептоспироза различны — от легких до тяжелейших, приводящих к смерти.

2. Характеристика возбудителя

2.1. Материал для исследования

Материалом для исследования слу­жат: кровь (лучше брать на 3...5 сутки болезни при повышенной температуре тела), моча, кусочки паренхиматозных органов, поч­ка, транссудат из грудной и брюшной полостей, мочевой пузырь с содержимым, абортированный плод. Патологический материал отбирают не позже 2 ч после гибели животного. Мочу собирают при естественном мочеиспускании; в летнее время исследуется не позднее 3 ч после взятия.

Микроскопия. Исследуют мочу, цитратную кровь, тка­невую суспензию из коркового слоя почки, печени, у плода - из всех органов. Микроскопию проводят в раздавленной капле с конденсором «темного поля». Типичные лептоспиры активно подвижны и имеют форму прямой или S-образной с загнутыми в виде крючков концами серебристо-белой нити. Лептоспир также можно обнаружить в срезах из органов после импрегнации сереб­ром по методу Левадити.[5]

Выделение культур. Материал засевают по 1...3 кап­ли в 3...5 пробирок со специальной питательной средой и инкуби­руют при 28...30°С в течение З мес. Лептоспиры начинают раз­множаться через 7...20 сут., иногда через 1...2 и очень редко — 3 мес. Наличие роста определяют темнопольной микроскопией раздавленных капель на 3, 5, 7, 10-е сутки и далее через каждые 5 сут. При обнаружении размножения лептоспир делают пересев в 3...5 пробирок со свежей средой. Выделить культуры лептоспир удается не всегда.[4]

Биологическая проба. Метод более чувствительный, чем культуральный; проводится с целью выделения и очистки культур лептоспир, определения их вирулентности и дифферен­циации от сапрофитов.

Заражают 20-30-суточных золотистых хомяков и крольчат-со­сунов в возрасте 10-20 суток. Каждую пробу испытывают на двух животных; на 4-5-е сутки убивают первого, на 14-16-е сутки — второго, если оно не погибло раньше. Из сердца, печени и почек убитых или павших животных проводят посевы. Сыворотку крови убитого через 14-16 сутки животного исследуют в реакции микроагглютинации (РМА) с лептоспирами 13 серогрупп. Положительная РМА в разведении 1:10 и выше указывает на наличие лептоспир в исследуемом материале.

Серологическое исследование. Для серологи­ческой диагностики лептоспироза используют РМА и реакцию аг­глютинации (РА). Пробы крови берут на 5-7-е сутки болезни и при необходимости повторно через 7-10 сут. Следует учитывать, что антитела в крови у выздоровевших животных могут сохранять­ся до двух лет и более.

РМА ставят в лунках полистироловых пластин. В качестве ан­тигенов используют живые 5-15-суточные культуры лептоспир 13-16-й серогрупп. Сыворотку исследуют с антигенами каждой серогруппы в разведениях 1:5, 1:10 и т.д. до титра. В лунки вно­сят по 0,1 мл разведенной сыворотки и 0,1 мл антигена. Контро­лем служит антиген с физиологическим раствором (по 0,1мл). Пластины выдерживают при 30°С в течение 1 ч; результаты учи­тывают в препаратах раздавленной капли в микроскопе с конден­сором темного поля. Агглютинация проявляется в склеивании лептоспир и образовании «паучков», состоящих из нескольких де­сятков или сотен бактерий. Свободные концы лептоспир сохраня­ют подвижность. Оценивают реакции в крестах по 4-балльной си­стеме: положительная — не менее чем два креста в разведении сы­воротки 1:50 и выше, при отсутствии агглютинации в контроле.

РА ставят на стеклянной пластинке, на которую наносят каплю разведенной 1:100 исследуемой сыворотки и добавляют равное ко­личество антигена. Лептоспирозные антигены для РА выпускают шести серогрупп (для каждой отдельно), представляющие собой концентрированную взвесь лептоспир в альбуминовой питатель­ной среде. При наличии в сыворотке специфических антител на­ступает агглютинация. Оценка результатов производится в крестах по 4-балльной системе. Положительной считают реакцию два кре­ста и выше, сомнительной — один крест. Для выявления лепто­спир в крови, моче, паренхиматозных органах, в тканях абортированного плода, в воде и почве предложен иммунофлюоресцентный метод.[9]

2.2. Морфология

Лептоспиры — спиралевидные бактерии диамет­ром 0,1-,25 мкм и длиной от 6-5 до 30 мкм, образующие около 20 мелких, тесно расположенных первичных завитков и 1-2 вто­ричных, придающих клетке форму букв G, S, С. Осевая нить со­стоит из двух фибрилл. В темном поле они имеют вид тонких се­ребристых нитей с утолщенными и загнутыми в виде крючков концами. У клеток некоторых штаммов концы прямые
(бескрючковые лептоспиры).

Рисунок 1. Лептоспира (микроскопирование в темном поле)

Для лептоспир характерна активная подвижность, наиболее ча­стый тип движения — вращательно-поступательный. Спор не об­разуют. Грамотрицательные, плохо окрашиваются анилиновыми красителями, по Романовскому—Гимзе — в красный цвет, фиксация мазка существенно изменяет их мор­фологию; используют также метод имп­регнации серебром по Левадити.[1]

2.3. Культуральные свойства микроорганизма

Лептоспиры — хемоорганотрофные факультативно-анаэроб­ные бактерии. Культивируют их в аэроб­ных условиях при 28...30°С на специальных средах, содержащих 5...10% сыворот­ки крови кролика или овцы, дистиллиро­ванную, водопроводную, колодезную во­ду или фосфатный буфер (рН 7,2-7,6): среды Уленгута, Терских, Ферворта—Воль­фа, Любашенко и др. Рост лептоспир обыч­но проявляется через 7-20сут, иногда 1-2 мес. Среда при этом не изменяется.

Среда Уленгута. Готовят ее из водопроводной воды (рН 7,2-7,3), стерилизуют дробно текучим паром. К 10 объемным частям во­ды добавляют 1 часть стерильной сыворотки крови лошади или кро­лика, смешивают, разливают асептически в пробирки по 3 мл и за­ливают 1 мл стерильного жидкого парафина.[6]

Среда Ферворта — Вольфа (модификация С. И. Тарасова)

900 см3 дистиллированной воды смешивают с 0,5 г натрия хло­рида, 1 г пептона Дифко или Витте, 100 см3 концентрированного раствора фосфатного буфера (рН 7,2). Смесь в колбе автоклавируют при 105 ± 1 0С в течение 30 мин. На следующий день ее дважды фильтруют через бумажный фильтр, разливают в пробирки по 5 см3 и снова автоклавируют 30 мин при 120 ± 1 0С. В пробирки с прозрачной средой добавляют по 0,5 см3 кроличьей сыворотки и прогревают на водяной бане при 56—58 °С в течение 30 мин.

Для проверки на стерильность пробирки со средой выдержива­ют в термостате 3—5 суток при 37 °С.[3]

Среда Любашенко. Фильтрованную через бумажный фильтр нехлорированную водопроводную воду (или колодезную, речную) стерилизуют в автоклаве при 1 атм. 30 мин, охлаждают, устанавли­вают рН 7,3—7,4, добавляют 5 % сыворотки крови кролика или барана, прогретой при 56°С в течение I ч. Затем среду пропускают через фильтрующие пластины СФ в фильтре Зейтца и асептически (в боксе) разливают в пробирки. Для контроля стерильности среды пробирки помещают в термостат при 370 С на 48 ч.

На плотных средах (Кокса, ВГНКИ) образуют колонии S-, О- и R-форм. S-форма — типичная для патогенных штаммов, ее коло­нии прозрачные, в виде диска с ровным краем.

2. 4 Биохимические свойства

Изучены недостаточно. Способность ферментировать углеводы отсутствует; образуют каталазу, оксидазу, липазу и другие ферменты.[2]

2. 5 Токсинообразование

Истинный экзотоксин лептоспиры не синтезируют. Они образуют эндотоксин и патогенные ферменты: гемолизин, фибринолизин, плазмокоагулазы, гиалуронидазы, ли­пазы, лецитиназу, которые выделяются в результате лизиса леп­тоспир. Патогенностью обладают свежевыделенные штаммы леп­тоспир; при культивировании на питательных средах это свойство относительно быстро теряется.

2. 6 Антигенная структура

Лептоспиры обладают белковым сомати­ческим антигеном, определяющим их видовую специфичность. Поверхностные полисахаридные антигены служат критериями групповой и серовариантной дифференциации. Антигенные свой­ства лептоспир изучают в реакции микроагглютинации и методом иммуноадсорбционного анализа.

2. 7 Устойчивость

Резистентность лептоспир к физическим и химическим средствам соответствует устойчивости вегетативных форм бактерий. Лептоспиры — типичные гидробионты. В воде рек и озер сохраняются до 200 дней, в сточных водах — до 10 дней, в навозной жиже — 24 ч, во влажной почве с нейтральной или слабощелочной реакцией — до 279 дней, но быстро (0,5-2,5 ч) погибают в сухой почве.

В моче крупного рогатого скота, свиней и грызунов они сохраняются от 4 ч до 6-7 дней в мышечной ткани – 48 ч; в свежем молоке — 8...24 ч; в почках убойных животных при 0...4°С — до 28 суток; в замороженном мясе погибают через 10 суток. Чувствительны к действию поваренной соли: в засоленном (4,8 % NaCl) мясе крупного рогатого скота погибают через 10 суток; в гипертоническом растворе поваренной соли (2,8 %) — через 15 мин.[7]

При кипячении погибают моментально, при 56...580С — в те­чение 25...30 мин. Быстро гибнут при высушивании и под воздей­ствием прямого солнечного света. Низкие температуры консервируют лептоспир. Растворы (0,1%-й соляной кис­лоты, 0,5%-й фенола) инактивируют лептоспиры за 20 мин. Лептоспиры чувствительны также к некоторым антибиотикам и химиотерапевтическим препаратам.

3. Биопрепараты и иммунитет

После переболевания у животных формируется длительный и напряженный иммунитет. Он характеризуется серовариантной специфичностью, поэтому возможны реинфекции. Ведущее значение в невосприим­чивости к лептоспирозу принадлежит антителам, и особенно IgG. Сыворотки иммунных животных обладают превентивными свой­ствами. Отмечается также длительное лептоспироносительство и вследствие этого инфекционный иммунитет.

Вакцинацию коров проводят за 1,5...4мес, овец и свинома­ток—за 1,5...2 месяцев до родов, колостральный иммунитет продол­жается у телят до 2,5 месяцев, у ягнят и поросят до 3 недель.

Для активной иммунизации применяют депонированную поливалентную вакцину ВГНКИ против лептоспироза животных. Вакцину выпускают в двух вариантах: первый — из штаммов леп­тоспир серогрупп помона, тарассови, иктерогеморрагия и каникола, второй — из серогрупп помона, тарассови, гриппотифоза и че­тырех сероваров группы гебдомадис. Иммунитет после вакцина­ции наступает через 14...20 суток и длится у молодняка до 6 месяцев, у взрослых животных — до одного года.

Для пассивной иммунизации и лечения больных животных ис­пользуют гипериммунную сыворотку против лептоспироза сельс­кохозяйственных и промысловых животных, которую получают из крови волов-продуцентов, иммунизированных культурами лептослир. Иммунитет у животных, привитых сывороткой, сохраня­ется 10—14 суток.[10]

Заключение

Лептоспироз — инфекционная, природно-очаговая, нетрансмиссивная болезнь многих видов животных, в том чис­ле птиц, проявляющаяся кратковременной лихорадкой, гемоглобинурией, желтушным окрашиванием и некрозами слизистых оболо­чек и кожи, атонией желудочно-кишечного тракта, абортами, мас­титами, рождением нежизнеспособного потомства, снижением про­дуктивности животных или протекающая бессимптомно, к лептоспирозу восприимчив и человек.

В темном поле микроскопа лептоспиры имеют вид тонких серебристых нитей с загнутыми концами, обладающих разными движениями. Лептоспир выращивают на жидких, полужидких и плотных питательных средах. Наилучшие условия для культивирования - температура 26-28°С и рН 7,2-7,4. Факторами патогенности лептоспир являются экзо- и эндотоксины (обусловливающие гемолитическое и цитотоксическое воздействие возбудителя на макроорганизм), плазмокоагулаза, липаза, фибринолитический фермент, эстераза и др.

Лептоспиры весьма устойчивы к различным физическим и химическим факторам.

После переболевания у животных формируется длительный и напряжённый иммунитет. Существуют различные средства иммунизации путём применения поливалентной вакцины или гипериммунной сыворотки.

Список литературы

1.                      Артемьева С. А., Артемьева Т. Н., Дмитриев А. И., Дорутин В. В. «Микробиологический контроль мяса животных, птицы, яиц и продуктов их переработки», М.: Колос, 2002 г.

2.                      Бакулов И. А., Ведерников В. А., Семенихин А. И. «Эпизоотология с микробиологией», М.: Колос, 2000 г.

3.                      Колычев Н. М., Госманов Р. Г. «Ветеринарная микробиология и иммунология», М.: Колос, 2003 г.

4.                      Конопаткин А. А., Артемов Б. Т., Бакулов И. А.»Эпизоотология и инфекционные болезни», М.: Колос, 1993 г.

5.                      Кузнецов А. Ф. «Справочник ветеринарного врача», СПб.: Лань, 2002 г.

6.                      Малахов Ю. А. «Лептоспироз животных», М.: Агропромиздат, 1992 г.

7.                      Мишанин Ю. Ф. «Справочник по инфекционным болезням животных», Ростов-на-Дону, 2002 г.

8.                      http://www.infekcii.net/patogenez-leptospiroza/

9.                      Радчук Н. А., Дунаев Г. В., Колычев Н. М. «Ветеринарная микробиология и иммунология», М.: Агропромиздат, 1991 г.

10.                  Шесточенко М. А. «Коварство вирусов и бактерий. Малоизученные и традиционные инфекции, угрожающие жизни животных и людей», М.: «Звонница» 2006 г.

4