Этапы получение лизина

     Степень стерильности среды, оборудования и  коммуникаций проверяют следующим  образом. Простерилизованную среду  или смывы, произведенные стерильной водой с внутренних поверхностей аппаратов и трубопроводов, высевают на агаризованные или жидкие питательные среды и инкубируют в термостате в течение суток. Если среды остаются стерильными, значит, стерилизация проведена правильно. Такой анализ проводят при пуске завода, в случае появления инфекции и периодически в профилактических целях. 

Культивирование продуцента лизина в  промышленных ферментаторах 

     Выращивание производственной культуры продуцента лизина осуществляется, как правило, периодическим способом в ферментаторах. В отличие от аппаратов, используемых при производстве кормовых дрожжей, ферментаторы имеют меньшие габаритные размеры и рассчитаны на 50, 63 и 100 м³. Все они предназначены для выращивания культуры в асептических условиях со строгим соблюдением герметизации процесса. Ферментаторы снабжают необходимыми коммуникациями, системой подачи стерильного пеногасителя, охлаждающими теплообменными устройствами и устройствами для перемешивания и введения в питательную среду стерильного воздуха, дополнительных питательных ингредиентов, а также растворов кислот или щелочей для поддержания рН среды на заданном уровне. На рис. 2 представлен общий вид ферментатора для выращивания продуцента в асептических условиях

     .

Рис. 2. Ферментатор вместимостью 50 м³:

1 —  теплообменник; 2 — электродвигатель; 3 — привод мешалки; 4 — соединительная  муфта вела; 5 — гильза для термометра; 6 — барботер; 7 — корпус аппарата; 8 — растяжка для центровки вале; 9 — лопасти мешалки; 10 — мешалка; 11 — опора аппарата

     Стерильную  среду в ферментатор вводят при  температуре, близкой к температуре  выращивания продуцента (32-35 °С), или около 80 °С. Во втором случае для окончательного охлаждения аппарата и среды используют теплообменные устройства самого ферментатора.

     При достижении оптимальной температуры  среды из посевного ферментатора подают посевной материал и тут же начинают аэрацию содержимого ферментатора. Коэффициент заполнения аппарата 0,65-0,75 в зависимости от степени ценообразования в данных условиях культивирования.

     В ферментаторе устанавливают определенный режим культивирования в зависимости от особенностей продуцента. Для продуцентов лизина длительность ферментации составляет 58-72 ч.

     В первые сутки микроорганизмы ассимилируют приблизительно 25 % общего азота среды, углеводов и почти все аминокислоты. За это время накапливается почти  вся биомасса. Вторая стадия роста  культуры сопровождается резким замедлением накопления биомассы и самыми высокими скоростями биосинтеза лизина. Питательная среда сильно истощается, изменяется рН. На этой стадии целесообразно проводить подтитровывание среды 25 %-ным раствором аммиака или 15 %-ным раствором NaОН с целью стабилизации рН и дополнительно вводить питательные вещества (подпитка). Последняя стадия выращивания продуцента лизина характеризуется некоторой убылью биомассы за счет небольшого автолиза клеток и резким снижением скорости накопления лизина.

     Как отмечалось выше, на биосинтез лизина существенное влияние оказывают  аэрация и перемешивание. Поэтому  на всех стадиях процесса все параметры культивирования строго регламентируются и контролируются (температура, рН, изменение основных компонентов среды, накопление лизина, аэрация, перемешивание и т. д.).

Для реализации процесса получения продукта микробиологического синтеза определяют время начала подачи подпитки, а также изменения расходов растворов питательных ростовых веществ и стерильной воды, обеспечивающие максимизацию производительности аппарата. Например, после рассмотрения физиологической активности культуры Вгеvibacterium 22ЛД в периодическом процессе на питательной среде с ферментолизатом БВК при культивировании в ферментаторе объемом 100 м³ на Шебекинском биохимическом заводе для введения подпитки (40 %-ный раствор мелассы и 1,4 %-ный раствор солей) был выбран период с 12-го по 15-й ч культивирования, который характеризуется наибольшей скоростью лизинообразования. Подачей мелассной подпитки в питательную среду вводили 5-6 % сахаров. За 65 ч культивирования синтезировалось 47 г/л лизина. Выход лизина составлял 31 % по массе введенного сахара.

     Готовая культуральная жидкость помимо лизина содержит биомассу продуцента, остатки непотребленных питательных веществ среды, продукты обмена веществ. 

Выделение целевого продукта (L-лизина) 

     В зависимости от последующего назначения препарата можно на основе культуральной  жидкости получить технические препараты  в виде жидкого концентрата лизина (ЖКЛ) и сухого кормового концентрата лизина (KKJI), а также кристаллический лизин. Для каждого из этих продуктов существует своя технология.

     Для кормовых целей целесообразнее получать технические препараты ЖКЛ и ККЛ, так как они содержат помимо лизина значительное количество других важных для организма животного соединений, в частности витамины: рибофлавин, пантотеновую, фолиевую и никотиновую кислоты и др.

     Технические препараты лизина получают на основе всей суммы веществ, присутствующих в культуральной жидкости, включая  биомассу продуцента и твердые нерастворимые частицы среды. Поскольку культуральная жидкость имеет сравнительно низкое содержание сухих веществ (10-13 %) и не обладает стабильностью при хранении, концентрацию сухих веществ увеличивают методом выпаривания или высушивания. Готовая культуральная жидкость перед концентрированием должна содержать минимальное количество редуцирующих сахаров, так как в процессе концентрирования они могут образовывать при участии ε-аминогруппы лизина соединения, не усваиваемые животными, т. е. происходит безвозвратная потеря целевого продукта.

     Для стабилизации лизина культуральную  жидкость подкисляют соляной кислотой до pH 5 и добавляют 25 %-ный раствор метабисульфита натрия в количестве 0,4 %. Далее стабилизированную культуральную жидкость выпаривают в вакуум-выпарной установке до концентрации сухих веществ 35-40 %. Потери лизина на этой операции составляют от 5 до 15 %. Вязкость ЖКЛ 0,648 ^. 10^-3 кг/(м ^. с), температура замерзания – 18 °С, удельная масса 1,150-1,300, pH 4,5-6.

     Жидкий  концентрат лизина хорошо сохраняется  в течение 3-4 месяца. Считается, что он обладает большей биологической ценностью, чем сухой ККЛ. Для получения сухого ККЛ жидкий концентрат высушивают на распылительных сушилках до влажности 5-6 %. Полученный ККЛ содержит до 15-20 % лизина в виде монохлоргидрата, около 15-17 % белка, до 14 % других аминокислот, 10-13 % бетаина и около 20-25 % зольных веществ. Но сухой ККЛ, получаемый высушиванием стабилизированной и сконцентрированной культуральной жидкости, имеет недостаток - он очень гигроскопичен (его гигроскопическая точка при 20 °С равна 20-22 % относительной влажности воздуха) и при хранении слеживается. Образующиеся при этом крупные комки затрудняют его дальнейшее продуктивное использование как при приготовлении комбикормов, так и непосредственно на животноводческих фермах.

     Имеется несколько способов ликвидации этого  недостатка. По-видимому, большая гигроскопичность сухого препарата связана с высоким содержанием сахаров и органических кислот, которое можно снизить введением в культуральную жидкость наполнителей (костной муки, оксида кальция, бентонита, пшеничных отрубей) и последующей сушкой. В результате получается сыпучий менее гигроскопичный продукт.

     Известен  метод выращивания на готовой  культуральной жидкости, содержащей лизин, специальных видов дрожжей, усваивающих углеводы и органические кислоты. Из культуральной жидкости исчезают нежелательные компоненты (сахара и органические кислоты), и она дополнительно обогащается кормовым белком (дрожжи).

При такой  технологии ККЛ получается менее  гигроскопичным и более сыпучим. Жидкий и сухой концентраты лизина приблизительно одинаковы по своему составу, если приготовлены без наполнителей. Если же вводят наполнители, к сумме сухих веществ культуральной жидкости прибавляют еще и их сухие вещества.

     На  основе готовой культуральной жидкости можно получать кристаллические  препараты лизина. Первым этапом в  этой технологии является освобождение от твердой взвеси центрифугированием и получение фильтрата культуральной  жидкости, из которой лизин извлекают с помощью ионообменной смолы КБ-4П-2 или КУ-2. Сорбция лизина осуществляется на катионит в аммонийной форме

Лизин ^{+ 2} (NН₄⁺) • Катионит → (2 NН₄ ⁺) + (Лизин⁺²) • Катионит.

     Затем колонки тщательно промывают  до бесцветной промывной воды и осуществляют элюцию лизина с катионита 0,5-5 %-ным раствором аммиака до отсутствия следов лизина в последних порциях стекающего элюата и получают 1-2 %-ный раствор лизина. В элюат переходит 80-90 % сорбированного лизина. Десорбция лизина протекает по следующей схеме

(Лизин  ⁺²) • Катионит + (2 NН₄ ⁺) → Лизин⁺² + 2 (2 NН₄ ⁺) • Катионит.

     Помимо  лизина элюат содержит значительное количество аммиака, который удаляют при нагревании, а освобожденный от аммиака элюат подкисляют соляной кислотой до рН 4,9-5 и выпаривают в вакуум-выпарном аппарате при температуре 60 °С до концентрации лизина 30-50 %. При взаимодействии лизина с соляной кислотой образуется монохлоргидрат лизина, который выпадает при охлаждения до температуры 10-12 °С из концентрата в виде желтоватых кристаллов. Последние отделяют от маточного раствора и, если предполагается использовать лизин для кормовых целей, высушивают и фасуют, маточный же раствор отправляют на повторное концентрирование для утилизации оставшегося в нем лизина. Если предполагается получение высокоочищенных препаратов лизина, кристаллы первой ступени выделения подвергают многостадийной очистке от красящих веществ и других примесей. Перекристаллизацию лизина проводят из раствора в этиловом спирте. Очищенный лизин используют для пищевых, медицинских и других целей. Товарный продукт содержит не менее 97 % основного вещества -  L-лизина дигидромонохлоргидрата. Влажность продукта не выше 0,5 %, зольность до 0,3. Выпускают его в виде малогигроскопичного порошка белого или бледно-кремового цвета, без запаха, горько-соленого вкуса.

     Потери  лизина в процессе выделения кристаллического препарата составляют около 30 %.

     Завершается процесс производства лизина любой  степени чистоты фасовкой, упаковкой  и складированием готового продукта. Фасуют препараты в полиэтиленовые мешки, которые герметизируют и  дополнительно упаковывают в крафт-мешки или в случае кристаллического препарата - в картонные коробки. 
 
 
 

СПИСОК  ЛИТЕРАТУРЫ

     1. Биотехнология: Учеб. Пособие для вузов. В 8 кн./Под Б 63 ред. Н. С. Егорова. В. Д. Самуилова. Кн. 6: Микробиологическое производство биологически активных веществ и препаратов/Быков В. А., Крылов И. А., Манаков М. Н. и др. – М.: Высш. шк., 1987. – 143 с.: ил.

     2. Бекер М. Е., Лиепиньш Г. К., Райпулис Е. П. Биотехнология, М., ВО Агропромиздат. 1990.

     3. Биотехнология // Под ред. А. А. Баева. – М.: Наука, 1984. С. 311