Культуры клеток и тканей, методы культивирования вирусов. Вирусологические методы исследования

Культуры клеток и тканей, методы культивирования вирусов. Вирусологические методы исследования. 

Выполнил (а): Кинжебаева Ж 

266  ОМ  

АО «Медицинский  Университет Астана» 

Астана 2011 г. 

СРС

Введение 

• Для количественного  накопления вирусов наиболее  удобную систему представляют  культуры клеток. В конце прошлого  столетия нашли возможность сохранения  жизнеспособности тканей и клеток  в искусственных условиях и  положили начало глубоким научным  исследованиям тканевых культур. Культивирование вирусов помогает  решить ряд теоретических проблем, связанных с изучением особенностей  взаимодействия "вирус-клетка". Кроме  того, решение целого ряда прикладных  задач, связанных с диагностикой  и производством препаратов для  профилактики вирусных инфекций, невозможно без накопления вирусосодержащего  сырья.

Культура  клеток и тканей 

•  - метод сохранения в жизнеспособном состоянии клеток, участков тканей, органов или их частей вне организма.

      Одна из самых ранних культур клеток человека, полученная от Генриетты Лакс, которая умерла от рака шейки матки. Культура клеток HeLa окрашена по Хойсту. Измененные ядра окрашены в синий цвет.

Виды  культур тканей и клеток 

• I. Культуры переживающих эксплантатов тканей.

 

• II. Культуры растущих тканей: 
  1) культуры фиксированных кусочков ткани; 
  2) однослойные культуры клеток:

а) первично-трипсинизированные (однократно культивируемые);

б) перевиваемые клеточные культуры;

в) полуперевиваемые культуры клеток (штаммы диплоидных клеток человека и животных) 

• III. Суспензионные культуры растущих клеток. 
  

 

(В зависимости  от методики первичной эксплантации  ткани и техники ее культивирования)

• Окрашенная культура клеток эпителия. На фотокератин (красный) и ДНК(зеленая)

• Клеточные и тканевые культуры позволяют исследовать такие важные для медицины проблемы, как перерождение нормальных клеток в опухолевые, всесторонне изучать их свойства, чувствительность клеток к физическим и химическим факторам, в т. ч. к лекарствам, а также определять потенциальную мутагенность и канцерогенность этих факторов, т. е. их способность вызывать мутации и опухоли.

однослойные 

первичные  

перевиваемые  

клеточная культура,

полученная 

непосредственно  из 

тканей человека  или 

животных в  эмбриональном

 или постнатальном периоде  

линии  

штампы  

Характеризуются

 потенциальным

 бессмертием и

гетероплоидным 

кариотипом 

полуперевиваемые  клетки 

с диплоидным  набором 

хромосом  и ограниченной 

продолжительностью 

жизни in vitro  

Отдельные клетки  сохранившие способность к жизни  и размножению. 

Однослойные  культуры растущих клеток составляют 
основную культуру клеток современной лабораторной и производственной вирусологической практики.

• Способность  перевиваемых клеток к бесконечному  размножению in vitro знаменует собой  качественный скачок, в результате  которого клетки приобретают  способность к автономному существованию, подобно микроорганизмам, выращиваемым  на искусственных питательных  средах. Совокупность изменений, приводящих  к появлению у клеток таких  особенностей, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур — трансформированными.

Культивирование  вирусов 
Для выделения и культивирования вирусов используются чувствительные биологические модели:  
 

• Лабораторные  животные. Основные экспериментальные модели: белые мыши (при выделении вирусов бешенства, энцефалитов, гриппа и вирусов Коксаки), хорьки (вируса гриппа), кролики (вирусов оспы, бешенства), обезьяны (вируса полиомиелита).
• Развивающиеся куриные эмбрионы (7— 13-дневные). Преимуществом этого метода является отсутствие спонтанных вирусных инфекций, а замкнутая полость эмбриона служит надежной защитой от попадания микроорганизмов из окружающей среды. Культивирование в курином эмбрионе применяется при первичном выделении вирусов из патологического материала, а также при необходимости пассировать и сохранять вирусы, получать необходимое количество вирусов— при изготовлении некоторых живых вакцин и диагностических препаратов.
• Культуры клеток (первично-трипсипизированные, перевиваемые и полуперевиваемые линии) – однин из основных методов.

Культивирование  в культурах клеток и тканей.  

    В зависимости от свойств вируса и типа зараженных им клеток исходом взаимодействия вируса с клеткой могут быть следующие изменения культур клеток:

• Цитопатический эффект (ЦПЭ) — развитие дегенеративных процессов в клетках.
• Образование симпластов — гигантских многоядерных клеток в результате слияния цитоплазмы нескольких клеток и митотического деления.
• Образование включений — одно из проявлений ЦПЭ.
• Увеличение массы вирусов — образование бляшек или колоний вирусов (например, у вирусов оспы, кори, полиомиелита и др.)

Очень  трудоемкие и длительные, что  не позволяет широко применять  их для диагностики.

Для  идентификации вирусов, а также  ряда бактерий используют  серологические методы, в основе которых лежит прямое взаимодействие специфических антител с антигеном. С помощью антител, содержащихся в диагностических иммунных сыворотках, могут быть идентифицированы самые разнообразные антигены, в том числе и патогенных микроорганизмов. Серологические реакции дают возможность судить не только о динамике накопления антител в процессе заболевания, но и о напряженности иммунитета, возникающего после профилактических прививок.

На практике  наиболее широко применяются  реакции нейтрализации, связывания  комплемента, агглютинации, преципитации, нейтрализации и др.

Однако  наиболее точными являются серологические  реакции с участием меченых  антигенов или антител - метод флюоресцирующих антител (МФА) и иммуноферментного анализа (ИФА).

Принцип  МФА 

• состоит  во взаимодействии антигена и  антитела, меченного флюорохромом. Последний обладает свойством  люминесцировать в потоке ультрафиолетовых  лучей и не влияет на специфичность  антител. Результаты учитываются  фотометрически. МФА является экспресс-методом, который позволяет уже через 2-3 часа установить с достаточной  степенью точности этиологический  диагноз. Так, при клещевом энцефалите  максимальное число положительных  результатов МФА определяется  в первые 3 дня болезни.

 

Принцип ИФА