Капсулообраование бактерий

Рассмотрим морфологические элементы структуры бактерий, способные в той или иной степени выполнять непосредственную защитную функцию либо оптимизирующую их биологическую безопасность путем усиления биоадаптационных свойств15.

Клеточная стенка, обычно состоящая из пептидогликана, не только защищает за счет ригидности внутреннее содержимое клетки от механического, осмотического и других видов неблагоприятного действия внешней среды, но и поддерживает гомеостаз внутри клетки. Некоторые микроорганизмы образуют цисты, относительно устойчивые к неблагоприятным условиям внешней среды. Капсула, располагающаяся поверх клеточной стенки у большинства бактерий, защищает их от теплового действия (пересыхания), от фагов, токсинов и других видов негативного внешнего действия, за счет входящих в ее структуру полисахаридов, либо полипептидов или липидов. Общая капсула может окружать до четырех клеток (зооглей). Фимбрии помогают бактериям прилипать к другим клеткам, а фили - способствуют прикреплению патогенных бактерий к клеткам животного и человека16.

О наличии у некоторых бактерий ворсинок, с помощью которых они могут прикрепляться к клетке животных и человека сообщают и другие авторы17. Эти исследователи характеризуют высокую устойчивость к действию физических и химических факторов бактериальных спор, благодаря низкому содержанию в них воды и высокому содержания кальция. Эко-эпидемиологическая значимость некоторых микроорганизмов (вирусы), проявляется в том, что некоторые из них, будучи патогенными, способны вызывать заболевания у человека, животных, растений и насекомых. Проникновению вирусов в клетку способствуют их ферменты: нейраминидаза, разрушающая сиаловые кислоты оболочки клетки хозяина-макроорганизма; лизоцим и аденозинтрифосфатаза, способствующие проникновению нуклеиновой кислоты фага в бактериальную клетку и последующему выходу из нее. Предполагают также существование информационно-волновых вирусов, резонансно (дистанционно) взаимодействующих с вирусами, находящимися внутри клетки18.

Следует отметить, что опасные для человека патогенные микроорганизмы вероятно могут характеризоваться некоторым своеобразием биологических систем безопасности их функционирования, связанной со спецификой их взаимодействия с организмом хозяина (наличие бактериемии и т.д.). Это подтверждено фактом определения in vivo наличия бактерий непосредственно в кровотоке организма человека19.

Таким образом, приведенные литературные данные свидетельствуют о наличии у микроорганизмов различных структур, способствующих их выживанию во внешней среде. По нашему мнению, эти элементы и их совокупность можно систематизировать, с учетом направленности и специфики их действия, а также - с позиций необходимости наличия симбиотического элемента в биосистеме данного типа. Исходя из этого, к индивидуальным морфо-ультраструктурным факторам защиты можно отнести такие структуры микроорганизмов как клеточная стенка, капсула, спора бактерий. К индивидуальным защитно-приспособительным механизмам видимо относятся специфические адаптационные механизмы у бактерий, позволяющие существовать им в экстремальных условиях внешней среды (высокая температура и т.д.). Индивидуальные симбиотические защитные элементы клеточной структуры, например, фимбрии, могут способствовать некоторым бактериям взаимодействовать с другими клетками. К кооперативно-симбиотическим защитным механизмам видимо можно отнести формирование межклеточных структур, выполняющих защитную функцию, например, зооглей. Индивидуально-симбиотические специфические защитные механизмы, возникающие у микроорганизмов вероятно в процессе внутривидовой конкуренции (бактериофаги и др. фаги) и межвидовых конкурентных взаимодействий (паразитизм) в ходе естественного отбора, представлены адаптационно - агрессивными факторами: ферментами (лизоцим и др.) вирусов, продуцированием естественных антибиотиков некоторыми микроорганизмами и др.

ГЛАВА 2. ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ ЛИПОПОЛИСАХАРИД-БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ КАПСУЛЫ БАКТЕРИЙ AZOSPIRILLUM BRASILENSE SR80 И SP245 ПРИ РОСТЕ НА АГАРИЗОВАННОЙ СРЕДЕ

2.1 Материал и  методы исследования

Проведено сравнительное исследование структурных особенностей липополисахарид-белковых комплексов (ЛПБК) из капсульного материала бактерий Azospirillum brasiiense SR80 и Sp245, выращенных в жидкой и агаризованной питательных средах. Анализ данных ГЖХ и ЯМР-спектроскопии выявил отличия структуры липидной и полисахаридной составляющих ЛПБК исследуемых бактерий, в зависимости от условий их культивирования. Отличительной особенностью ЛПБК обоих штаммов, рост которых осуществлялся на плотной среде, являлось наличие ундекановой кислоты и дополнительного полисахарида галактановой природы.

Многообразие защитных реакций почвенных бактерий, возникающих при стрессовых воздействиях, позволяет им приспосабливаться к меняющимся условиям среды обитания. В качестве одного из адаптационных механизмов устойчивости к неблагоприятным факторам выступают изменения компонентов поверхности бактериальных клеток, которые участвуют во взаимодействии с различными объектами среды, в том числе с растительными организмами при формировании симбиозов. Такая стратегия переживания стрессовых условий характерна для грамотрицательных бактерий рода Azospirillum, способных активно влиять на развитие и рост многих растений, в том числе злаковых культур20. Показано, что у азоспирилл в ответ на изменения температуры, значений рН, концентрации хлорида натрия, природы источников углерода и азота и т.д. наблюдаются модификации состава, свойств и структур гликополимеров поверхности: экзополисахаридов (ЭПС), капсульных полисахаридов (КПС) и липополисахаридов (ЛПС) внешней мембраны.21

Условия среды непосредственно влияют на формирование и эффективность растительно-микробных взаимодействий, поэтому изучение защитных реакций азоспирилл в ответ на стрессовые воздействия на молекулярном уровне поможет оптимизировать использование биологических удобрений как альтернативу химическим.

Ранее на примере бактерий A. brasilense SR80 было показано, что увеличение продолжительности выращивания до пяти суток, соответствующих стационарной фазе роста, в жидкой питательной среде не сопровождалось изменениями в структуре высокомолекулярной фракции КПС - липополисахарид-белкового комплекса (ЛПБК). В то же время выращивание данной культуры на агаризованной среде вызывало повышение содержания галактозы в моно-сахаридном составе ЛПБК22. Наличие сведений о сходстве адаптивных реакций азоспирилл в ответ на неблагоприятные воздействия окружающей среды23 подтверждают актуальность дальнейших исследований отмеченных ранее изменений капсульных гликополимеров. В связи с этим целью нашего исследования являлась сравнительная характеристика структурных изменений ЛПБК бактерий A. brasilense SR80 и Sp245 при переходе от планктонной формы существования в иммобилизованную на поверхности агаризованной среды.

В работе были использованы бактерии A. brasilense SR80 и Sp245, любезно предоставленные коллекцией ризосферных микроорганизмов ИБФРМ РАН (г. Саратов). Исследуемые культуры выращивали в жидкой синтетической питательной среде до окончания экспоненциальной фазы роста, а также на поверхности 2%-ной агаризованной среды при 30°С в течение 72 ч (стационарная фаза роста). С поверхности клеток удаляли капсулу отмыванием 0.15 M NaCl с 0.02%-ным NaN3 при механическом перемешивании на протяжении шести суток с ежедневной заменой отмывающего раствора24. Капсульный материал, собранный в течение первых двух дней отмывания клеток, концентрировали, диализовали, центрифугировали при 13000xg и лиофилизировали. Фракционирование КПС осуществляли гель-фильтрацией на колонке с носителем Sepharose CL-4B (45 х 1.8 см, V0 = = 35 мл) с 0.025 M бикарбонатаммонийным буфером (рН 8.3) в качестве элюента и собирали фракции, соответствующие ЛПБК.

Деградацию ЛПБК выполняли 2%-ной уксусной кислотой при 100°С в течение 1.5 ч. Для отделения нерастворимых в воде липидов А гидролизаты центрифугировали при 13000xg. Водорастворимые фракции разделяли гель-проникающей хроматографией на колонках с носителем Sephadex G-50 (46 х 1.6 см, V0 = = 35 мл) с 0.025 М пиридин-ацетатным буфером (рН 4.5) в качестве элюента. Поглощение продуктов реакции элюата с фенолом и серной кислотой определяли спектрофотометрически при X = 490 нм на приборе Specord 40 (Analytik Jena AG, Германия).

Биополимерный состав гликополимеров капсулы устанавливали с использованием традиционных колориметрических методов, описанных в работе. Измерения оптической плотности продуктов реакций проводили на спектрофотометре Specord 40 (Analytik Jena AG, Германия).

Анализ моносахаридного состава осуществляли методом газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ) ацетатов полиолов  на хроматографе GC-2010 (Shimadzu, Япония), снабжённом капиллярной колонкой DB-5 (Hewlett-Packard, США), в градиенте температур от 160°С (1 мин) до 290°С со скоростью нагрева 7°С/мин.

Состав и соотношение жирных кислот липидов А в виде их метиловых эфиров (МЭЖК) определяли ГЖХ с использованием хроматографа GC-2010 (Shimadzu, Япония), снабжённого капиллярной колонкой EQUTY-1 в градиенте температур от 130 до 250°С со скоростью нагрева 4°С/мин. Метилирование жирных кислот осуществляли согласно.

Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) выполняли в 96-луночных полисти-рольных планшетах (Медполимер, Россия). По 50 мкл последовательных двукратных разведений образцов (в 0.15 М фосфатно-солевом буфере, pH 7.2) вносили в лунки планшетов. В эксперименте применяли поликлональные кроличьи анти-ЛПС антитела и козьи антикроличьи антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (Sigma, США). В качестве субстратного реагента использовали перекись водорода с о-фенилендиамином. Измерения оптического поглощения исследуемых проб проводили на им-муноферментном анализаторе Multiscan Ascent при X = 492 нм (Thermo scientific, Финляндия).

Спектры ЯМР снимали на спектрометре Avance II 600 (Bruker, Германия) в 99.96%-ной D2O при 27°С. В качестве внутреннего стандарта использовали ацетон. Образцы предварительно лиофилизировали дважды из 99.9%-ной D2O.

2.2 Результаты  исследования

Бактерии A. brasilense SR80 были выделены с поверхности проростков пшеницы Triticum aes-tivum L., произраставшей в Саратовской области25. Культура A. brasilense Sp245, которая была изолирована с поверхностно стерилизованных корней пшеницы, произраставшей в Бразилии, является эндофитом, колонизирующим внутренние ткани корней растения-хозяина. Сравнение защитных реакций бактерий р. Azospirillum, различающихся по способности заселять поверхность или внутренние ткани растительных организмов, важно для понимания механизма их адаптации к различным стрессовым воздействиям.

В ходе очистки и фракционирования КПС получены ЛПБК A. brasilense SR80 и Sp245 планктонных (ЛПБКSR80(пл) ЛПБК Sp245(пл)) и иммобилизированных (ЛПБК SR80(им) ЛПБК Sp245(им)) культур соответственно, выходы которых варьировали от 45 до 47%. В составе исследуемых гликополимеров были идентифицированы углеводы (29-88%), белки (до 3%),

2-кето-3-дезоксиоктоновая  кислота (0.6-1.8%), остатки фосфорной (до 1.5%) и характерных для азоспирилл  жирных кислот: 3-гидрокси-тетрадекановой, 3-гидроксигексадекановой и октадеценовой. Также в составе жирных кислот

ЛПБК SR80(им) и ЛПБК Sp245(им) впервые была обнаружена ундекановая (С11:0) кислота (16-23% от суммы идентифицированных МЭЖК). Ранее СП0 была выявлена как минорный компонент в составе липидов А ЛПС фитопатогенных бактерий Xanthomonas hortorum pv. vitians, а также Selenomonas sputigena, являющегося возбудителем периодонтита.

Углеводные составляющие исследуемых гликополимеров, полученные после мягкого кислотного гидролиза, разделяли гель-фильтрацией и собирали фракции, соответствующие полисахаридам (ПС), выходы которых варьировали от 28 до 36%.

Результаты исследования моносахаридного состава методом ГЖХ показали, что ПСsp245 (пл) состоял из рамнозы с примесью галактозы, а в ПСsp245 (им) было выявлено наличие рамнозы и галактозы в соотношении —1:1.6. Аналогичные изменения были обнаружены в составе ПСsp80(им): соотношение рамнозы, фукозы, ксилозы, галактозы и галактозамина составляло —1:4:1:12:1.5, что по содержанию галактозы в три раза выше по сравнению с ПСsR80 (пл).26

Предварительные исследования, проведённые методом спектроскопии ЯМР, показали, что в спектрах 1Н-ЯМР ПС(им) обоих штаммов присутствуют дополнительные сигналы, помимо тех, что характерны для ПС(пл) (рис. 1). Учитывая преобладание в моносахаридном составе ЛПБК SR80(им) и ЛПБК SR245(им) галактозы: можно предположить, что новый ПС по своей химической природе представлен галактаном.

Рисунок 1. 1Н-ЯМР спектры полисахаридов, выделенных из ЛПБК бактерий А. brasilense SR80 и SR 245 при планктонном (а, в) и иммобилизированном (б, г) культивировании27

Тестирование антигенных свойств методом ИФА показало взаимодействие как ЛПБК(им) так и ЛПБК(пл) бактерий А. brasilense SR80 и Sp245 с полученными нами ранее гомологичными антителами к препаратам ЛПС этих культур (рис. 2). Этот факт, очевидно, свидетельствует о присутствии в препаратах общих антигенных детерминант, что не исключает возможности появления в них и других антигенов. Из результатов ИФА следует увеличение интенсивности такого взаимодействия гомологичных антител с ЛПБК(им) обеих культур, по сравнению с ЛПБК(пл). Возможно, обнаруженный в ЛПБК(им) галактан способствует презентированию известных антигенных детерминант либо несёт дополнительные детерминанты, узнаваемые поликлональными антителами.

Рисунок 2. Иммуноферментный анализ ЛПБК бактерийA. brasilense SR80 (а) и Sp245 (б), выращенных в жидкой (I, III) и твёрдой (II, IV) средах, с анти-ЛПС антителами28

При использовании агаризованных сред для выращивания бактерий имеет место гипотетическая возможность попадания агарозы во фракции исследуемых гликополимеров при смыве культуры с поверхности среды. Поскольку одним из неотъемлемых компонентов агарозы является кислотолабильный сахар 3,6-ангидрогалактоза, наличие примесей в исследуемых нами препаратах ПС, получаемых в результате кислотного гидролиза, предполагается маловероятным.

На основании полученных результатов можно сделать вывод, что культивирование азоспирилл на плотной среде сопровождается продукцией нового гликополимера в составе капсулы. Так как этот полимер имеет галак-тановую природу, не исключено, что таким образом бактерии реагируют на смену условий существования, защищаясь как от избыточного количества кислорода, так и от других факторов среды. Выращивание бактерий A. lipoferum Бр59Ь в присутствии флавоноида кверцетина (стрессовые условия) также сопровождалось накоплением галактозы в составе образца КПС, помимо рамнозы и глюкозы29. Подобные изменения в структуре ЭПС A. brasilense Cd были показаны при культивировании бактерий в условиях солевого стресса. В моносахарид-ном составе ЭПС идентифицирована галактоза (~90%) и следовые количества других сахаров (глюкозы, маннозы, ксилозы, фукозы, рамнозы и арабинозы). Бактерии A. brasilense имеют два гена, кодирующих синтез фермента

УДФ-глюкоза-4-эпимеразы, который осуществляет внутримолекулярные превращения УДФ -глюкозы в УДФ-галактозу и наоборот. В ответ на стрессовые условия азоспириллы через экспрессию данных генов регулируют уровень УДФ-глюкозы и УДФ-галактозы, участвующих в синтезе ЭПС, тем самым изменяя его структуру30. Возможно, при росте бактерий A. brasilense SR80 и Sp245 на плотной среде синтез ЛПБК претерпевает аналогичные изменения. Индуцирование синтеза нового гликополимера на основе галактозы может являться одной из защитных реакций азоспирилл в ответ на изменение условий существования.