История развития и основные достижения современной генетики

       4. Временная организация  клетки. Клеточный и митотический циклы. 

       Клеточный цикл – это период жизнедеятельности клетки от момента её появления до гибели или образования дочерних клеток. Типы деления эукариотических клеток: амитоз, митоз, мейоз.

       Митотический  цикл – это период жизнедеятельности клетки от момента её образования и до разделения на дочерние. Митотический цикл включает интерфазу и митоз.

       Интерфаза – это период функционирования и подготовки клетки к делению, она подразделяется на три периода:

       а) Пресинтетический (постмитотический) G₁ – продолжительность от нескольких часов до нескольких месяцев и даже лет. Клетка выполняет свои функции, увеличивается в размерах, в ней идёт синтез белков и нуклеотидов, накапливается энергия и вещества. Такая клетка содержит диплоидный набор хромосом, каждая хромосома имеет одну хроматиду – 2n2c.

       б) Синтетический период S – продолжительность 6 – 8 часов. В клетке происходит репликация молекул ДНК и её содержание в клетке удваивается, т. е. каждая хроматида достраивает себе подобную, генетическая информация к концу периода 2n4c.

       в) Постсинтетический период G₂ – продолжительность меньше, чем у предыдущих периодов. Клетка готовится к делению, накапливается энергия, синтезируются белки веретена деления, постепенно затухают все синтетические процессы, необходимые для репродукции органоидов, меняется вязкость цитоплазмы, идёт интенсивный синтез АТФ и накопление энергии, происходит репликация центриолей и начало образования веретена деления. Генетическая информация 2n4c. Клетка вступает в митоз. 

       2) Митоз – это основной способ деления соматических клеток. Непрерывный процесс митоза подразделяют на 4 стадии: профазу, метафазу, анафазу и телофазу. В делящихся клетках в профазе все хромосомы сильно спирализуются, укорачиваются и приобретают компактные размеры и форму. Спирализация хромосом достигает максимума в метафазе и хромосомы удобнее всего изучать (метафазная пластинка). В анафазе центромеры каждой из хромосом разделяются и сестринские хроматиды с этого момента становятся самостоятельными дочерними хромосомами. В телофазе формируются ядра дочерних клеток: хромосомы деспирализуются, строятся ядерные оболочки, в ядре появляются ядрышки. После кариокинеза происходит цитокинез, митоз заканчивается образованием двух дочерних клеток, каждая из которых имеет двойной набор хромосом, каждая хромосома однохроматидная.

       Значение митоза в точном распределении генетической информации между дочерними клетками, в поддержании постоянства числа хромосом, в увеличении числа клеток, обеспечивающих рост организма и регенерацию тканей и органов.

       Эукариотические клетки могут делиться и прямым делением – амитозом. Это прямое деление клеток и ядер, находящихся в условиях физиологической и репаративной регенерации, или опухолевых клеток. При этом не происходит образования видимых хромосом и веретена деления, возникает перетяжка ядра, затем цитоплазмы, и разделение их на две части. В последнее время установлено, что при амитозе происходит также равномерное распределение генетического материала между дочерними клетками, хотя механизм его не вполне ясен.

       Патология митоза – эндомитоз, политения (эндорепродукция), образование новых клеток нарушается, а хромосомы продолжают удваиваться. В результате этого в клетках возникают необычайно крупные ядра. При эндомитозе происходит удвоение хромосом без деления ядра, что приводит к образованию полиплоидных клеток. При политении наблюдается многократное удвоение хроматид, но они не расходятся, и в результате образуются политенные (многонитчатые, гигантские) хромосомы, например, в слюнных железах мухи дрозофилы.  

       3) Мейоз – это деление половых клеток на стадии созревания, в результате которого образуются половые клетки, гаметы. Мейотическое деление протекает в два этапа – мейоз I и мейоз II. Каждое мейотическое деление подразделяют на 4 фазы: профазу, метафазу, анафазу и телофазу.

       Наиболее  сложной является профаза мейоза I. На этой стадии происходит конъюгация гомологичных хромосом и кроссинговер. Хромосомы образуют биваленты, состоящие из 4-х хроматид (4-х наборов ДНК). В анафазе гомологичные хромосомы, состоящие из двух хроматид, отходят к противоположным полюсам клетки. Расхождение хромосом носит случайный характер. Содержание генетической информации у каждого полюса становится 1n2c. В телофазе происходит образование двух дочерних гаплоидных клеток, но хромосомы не деспирализуются. После окончания мейоза I наступает короткий промежуток – интеркинез, в течение которого не происходят репликация ДНК и удвоение хроматид.

       Мейоз II протекает по типу обычного митоза. В анафазе этого мейоза к полюсам отходят хроматиды и содержание генетического материала становится 1n1c у каждого полюса клетки. В телофазе мейоза II после цитокинеза образуются клетки с гаплоидным набором хромосом, содержащих по одной хроматиде.

       Таким образом, в результате двух последовательных делений мейоза из одной диплоидной клетки образуется 4 гаплоидные.

       Значение  мейоза в редукции числа хромосом в половых клетках для последующего восстановления набора хромосом в зиготе, в конъюгации гомологичных хромосом и рекомбинации генетического материала.

       Патология мейоза – нерасхождение хромосом после конъюгации и, как следствие, избыток генетического материала или его недостаток в одной из дочерних клеток – хромосомные и геномные мутации. Также возможны мутации генные как при митозе, так и при мейозе. 

       5. Гетерохроматин и  эухроматин. 

       Упоминаемый ранее порядок чередования поперечных тёмных и светлых сегментов, образующийся при дифференциальной окраске хромосом, связан с различной степенью конденсации хроматина, зависящей от его функционального состояния. Гетерохроматиновые участки функционально менее активны, чем эухроматиновые. Они содержат прочитанную (транскрибированную ) ДНК, становятся более плотными и хорошо окрашиваются как в состоянии «покоя» так и при делении клетки. Эухроматиновые участки деконденсированы, т. е. более рыхлые, в них локализована большая часть генов, это активный участок хромосомы, окрашивается неинтенсивно. В хромосомах участки эу- и гетерохроматина чередуются и позволяют сделать анализ кариотипа, чтобы выявить нарушения, которые могут приводить к аномалиям развития, наследственным болезням или гибели плодов и эмбрионов на ранних стадиях развития.

       Анализ  кариотипа предполагает составление кариограммы или идиограммы – это систематизированный кариотип, в котором хромосомы располагаются по мере убывания их величины. Кариограмма – микрофотография хромосом, расположенных согласно строению и величине гомологичными парами.

       Техника подсчёта числа хромосом.

       Взятую  для анализа кровь разделяют: эритроциты осаждают 10%-ным раствором  желатина или центрифугированием; лейкоциты  помещают в специальную среду, содержащую 50 ингридиентов. Среди которых есть специфический белок фитогемагглютинин – вытяжка из семян бобовых. Благодаря ему лейкоциты начинают интенсивно делиться и хромосомы можно изучать на стадии метафазной пластинки. Культуру помещают в термостат в специальных флаконах на 3 дня при 37⁰ С. Потом в пробу добавляют алколоид колхицин, разрушающий нити веретена деления, деление приостанавливается, хромосомы не способны расходиться к полюсам клетки. Добавляют гипотонический раствор, проводят фиксацию и окрашивание. Затем хромосомы фотографируют, микрофотографию увеличивают в размерах, хромосомы вырезают, подбирают гомологичные пары по размерам, расположению центромеры, гетеро- и эухроматиновым участкам. 

       6. Половой хроматин. 

       Различия  полов обусловлены Х и У хромосомами (половыми). Половые отличия в строении ядер соматических клеток обнаружили в 1949 г. Бертрам и Барр, изучая нейроны кошки. Эти отличия присущи клеткам всех млекопитающих в период интерфазы. Интерфазные ядра содержат на переферии чечевицеподобные глыбки хроматина размерами от 1,8 до 1,2 мкм, примыкающие к ядерной оболочке и отличающиеся от ядрышек. Их назвали по имени исследователя «тельца Барра». Тельца Барра отсутствуют у самцов. Лейкоциты женщин содержат своеобразный придаток ядра, гомолог телец Барра, «барабанные палочки». Это - половой хроматин. Его наличие в клетках женщин связано с Х-хромосомами, которых у женщин две. Одна из них генетически менее активная, синтез ДНК в ней идёт позднее, она гетерохроматичная, окрашивается иначе, чем её гомолог. У мужчин половые хромосомы разные – Х и У, и они обе одинаково активны в интерфазе.

       Хроматин  половой – это отличия в интерфазном ядре соматических клеток особей женского пола у млекопитающих. По периферии ядер располагается глыбка хроматина – «тельце Барра», а в ядрах лимфоцитов находится придаток «барабанная палочка». У человека «тельца Барра» легче обнаружить в соскобе эпителия слизистой оболочки ротовой полости (буккального эпителия). Для выявления Х-хроматина окрашивание мазков проводят ацеторсеином и препараты просматривают в обычном световом микроскопе. Этот метод позволяет определить количество Х-хромосом в кариотипе. «Телец Барра» и «барабанных палочек» всегда на единицу меньше, чем число Х-хромосом.

       Техника исследования полового хроматина - см. стр. 50 пособие по генетике Карузиной.

       Исследования  полового хроматина имеют диагностическое  значение и используются при экспресс-анализе в скрининге. При обследовании больших групп людей на выявление каких-либо состояний (болезней или носительства) с целью активной профилактики тяжелых форм болезней, т. е.предположительного выявления не диагностированной ранее болезни с помощью простых методов, дающих быстрый ответ - массовый скрининг. 

       7. Современные методы  хромосомного анализа. 

       Изучением строения и функций хромосом занимается наука цитогенетика. Суть цитогенетических методов при всём разнообразии отдельных этапов заключается в микроскопическом анализе хромосом, позволяющем выявить числовые и структурные изменения хромосомного набора. Методы цитогенетического исследования можно условно подразделить на прямые и непрямые. Прямые методы – это получение препаратов делящихся клеток без культивирования. Непрямые – это получение препаратов хромосом из клеток, культивированных в искусственных питательных средах.

       Важный  момент для анализа хромосом является их окрашивание:

1. сплошное или равномерное рутинное окрашивание (красители азур-эозин или краситель Гимза), позволяет провести подсчёт хромосом и их групповую принадлежность, проанализировать повреждения хромосом (хромосомные аберрции), но не позволяет провести индивидуальную идентификацию хромосом;
2. метод дифференциального окрашивания хромосом (красители Гимза, флуоресцирующий краситель акрихин или акрихин-пирит), позволяет идентифицировать все хромосомы благодаря линейному рисунку – продольной окрашиваемости для каждой хромосомы в соответствии с типом окраски;
3. молекулярно-цитогенетический метод гибридизации (флуоресцентная гибридизация), основана на обработке препаратов хромосом специфическим ДНК-зондом, который присоединяется к исследуемой хромосоме и, после обработки специальными соединениями и флуоресцентными красителями, препарат исследуют с помощью флуоресцентного микроскопа; это самый высокий разрешающий уровень анализа хромосом, позволяющий определить локализацию гена и расшифровать сложные перестройки хромосом.

       Методы  цитогенетической диагностики часто  используют в комплексе с другими, что позволяет более точно  диагностировать сложные проявления наследственной патологии. Особое значение эти методы имеют при оказании помощи больным педиатрического, акушерско-гинекологического и эндокринологического профилей.

       Все вопросы назначения того или иного  цитогенетического исследования осуществляются при медико-генетическом консультировании. Проблемы, решаемые лабораторными цитогенетическими методами, следующие:

       -подозрение  на хромосомную болезнь по  клинической симптоматике;

       -наличие  у ребёнка множественных врождённых  пороков развития (МВПР);

       -многократные  спонтанные аборты, мёртворождения  или рождение детей с пороками развития;

       -нарушение  репродуктивной функции неясного  генеза у мужчин и женщин (первичная  аминоррея, бесплодный брак идр.);

       -существенная  задержка умственного и физического  развития ребёнка;

       -пренатальная  диагностика (риск по возрасту, при рождении предыдущего ребёнка с хромосомной болезнью);