Использование плазмид в генно-инженерных исследованиях

Плазмиды — дополнительные факторы наследственности, расположенные в клетках вне хромосом и представляющие собой кольцевые (замкнутые) или линейные молекулы ДНК.

Плазмиды способны удваиваться (реплицироваться) автономно, но при этом они эксплуатируют репликационную систему клетки хозяина. Большинство плазмид кодирует специальные белки — инициаторы репликации. Эти белки начинают процесс репликации, который затем подхватывается и продолжается репликационной системой клетки.

Для кольцевых плазмид известны несколько механизмов (способов) репликации:

• механизм катящегося кольца (rolling cycle),
• тетта-механизм (механизм «глазка»),
• D-механизм.

Существует несколько систем классификации  плазмид базирующихся на:

• топологии (линейные или кольцевые),
• механизмах репликации (см. выше),
• маркерных генов, содержащихся на плазмидах (например: устойчивость к антибиотикам, гены биодеградации ксенобиотиков, системы рестрикции — модификации, гены синтезабактериоцинов и т. д. — или полному отсутствию оных — криптические плазмиды),
• круге хозяев,
• копийности,
• совместимости,
• конъюгативные (способные к переносу в другие клетки)/неконъюгативные.

Вне зависимости от типа, все плазмиды содержат точку инициации репликации (ori V).

Плазмиды- экстрахромосомный генетический материал (ДНК), более просто устроенные по сравнению с вирусами организмы, наделяющие бактерии дополнительными полезными свойствами. По молекулярной массе плазмиды значительно меньше хромосомной ДНК, содержат от 40 до 50 генов.

Их объединение в одно царство жизни с вирусами связано  с наличием ряда общих свойств- отсутствием собственных систем мобилизации энергии и синтеза белка, саморепликацией генома, абсолютным внутриклеточным паразитизмом.

Их выделение в отдельный  класс определяется существенными  отличиями от вирусов.

1.Среда их обитания- только бактерии (среди вирусов , кроме вирусов бактерий- бактериофагов имеются вирусы растений и животных).

2.Плазмиды сосуществуют  с бактериями, наделяя их дополнительными  свойствами. У вирусов эти свойства  могут быть только у умеренных  фагов при лизогении бактерий, чаще же всего вирусы вызывают отрицательный последствия, лизис клеток.

3.Геном представлен двунитевой ДНК.

4.Плазмиды представляют  собой “голые” геномы, не имеющие  никакой оболочки, их репликация  не требует синтеза структурных  белков и процессов самосборки.

Плазмиды могут распространяться по вертикали (при клеточном делении) и по горизонтали, прежде всего путем конъюгационного переноса. В зависимости от наличия или отсутствия механизма самопереноса (его контролируют гены tra- оперона) выделяют конъюгативные и неконъюгативные плазмиды. Плазмиды могут встраиваться в хромосому бактерий- интегративные плазмиды или находиться в виде отдельной структуры- автономные плазмиды ( эписомы).

Классификация и биологическая  роль плазмид.

Функциональная классификация  плазмид основана на свойствах, которыми они наделяют бактерии. Среди них- способность продуцировать экзотоксины и ферменты, устойчивость к лекарственным препаратам, синтез бактериоцинов.

Основные категории плазмид.

1.F- плазмиды - донорские функции, индуцируют деление (от fertility - плодовитость). Интегрированные F - плазмиды-  Hfr- плазмиды (высокой частоты рекомбинаций).

2.R- плазмиды (resistance) - устойчивость к лекарственным препаратам.

3.Col- плазмиды- синтез колицинов (бактериоцинов)- факторов конкуренции близкородственных бактерий (антогонизм). На этом свойстве основано колицинотипирование штаммов.

4.Hly- плазмиды- синтез гемолизинов.

5.Ent- плазмиды- синтез энтеротоксинов.

6.Tox- плазмиды- токсинообразование.

Близкородственные плазмиды не способны стабильно сосуществовать, что позволило объединить их по степени родства в Inc- группы (incompatibility- несовместимость).

Биологическая роль плазмид многообразна, в том числе:

- контроль генетического  обмена бактерий;

- контроль синтеза факторов  патогенности;

- совершенствование защиты  бактерий.

Бактерии для плазмид- среда обитания, плазмиды для них- переносимые между ними дополнительные геномы с наборами генов, благоприятствующих сохранению бактерий в природе.

Мигрирующие генетические элементы - отдельные участки ДНК, способные  определять свой перенос между хромосомами  или хромосомой и плазмидой с помощью фермента рекомбинации транспозазы. Простейшим их типом являются инсерционные последовательности (IS- элементы) или вставочные элементы, несущие только один ген транспозазы, с помощью которой IS- элементы могут встраиваться в различные участки хромосомы. Их функции- координация взаимодействия плазмид, умеренных фагов, транспозонов и генофора для обеспечения репродукции, регуляция активности генов, индукция мутаций. Величина IS- элементов не превышает 1500 пар оснований.

Транспозоны (Tn- элементы) включают до 25 тысяч пар нуклеотидов, содержат фрагмент ДНК, несущий специфические гены, и два Is- элемента. Каждый транспозон содержит гены, привносящие важные для бактерии характеристики, как и плазмиды (множественная устойчивость к антибиотикам, токсинообразование и т.д.). Транспозоны- самоинтегрирующиеся фрагменты ДНК, могут встраиваться и перемещаться среди хромосом, плазмид, умеренных фагов, т.е. обладают потенциальной способностью распространяться среди различных видов бактерий.

Структура и репликация 
Мол. масса плазмид составляет от 1*10⁶ до 200*10⁶. Таким образом, самые мелкие плазмиды кодируют один-два белка среднего размера, тогда как более крупные — 300 или более белков. Крупные плазмиды могут кодировать множество ферментов, необходимых для работы целой последовательности биохимических реакций, например для превращения толуола в катехол. Плазмиды с мол. массой более 100-106 обнаружены только у грамотрицательных бактерий, в частности у видов Pseudo-monas и Agrobacterium. Мол. масса плазмид грамположительных бактерий лишь в отдельных случаях превышает 40-10⁶. 
В. бактериальных клетках плазмиды существуют в виде кольцевых двухцепочечных ДНК, которые, кроме того, находятся в сверхспиральном состоянии. Некоторые из плазмид могут существовать лишь в клетках одного или двух близких видов. К числу плазмид с широким кругом хозяев относятся RP4, R68.45, RK2 и сходные с ними плазмиды, несущие маркер устойчивости к лекарственным препаратам (R-плазмиды), которые принадлежат Р-группе несовместимости (члены одной и той же группы несовместимости не могут сосуществовать в бактериальной клетке). Эти плазмиды были перенесены во многие виды грамотрицательных бактерий; создается впечатление, что их хозяевами могут быть все штаммы грамотрицательных бактерий. 
Таким образом, R-плазмиды, относящиеся к группе Р, особенно подходят для генетических экспериментов с грамотрицательными бактериями, используемыми в промышленности. При помощи этих плазмид мы можем осуществлять перенос хромосомных генов между неродственными видами. Небольшие по размеру производные плазмид RP4 и RK2 используются как векторы для клонирования молекул ДНК, которая затем может быть перенесена в клетки самых разных видов.

Репликация некоторых  типов плазмид тщательно изучена, и нам известны сегодня многие детали этого процесса, особенно для небольшой плазмиды ColEl. Эта информация помогает при использовании плазмид для клонирования генов. Чаще всего применяют производные плазмиды pBR322 длиной 4362 пар нуклеотидов, несущей гены устойчивости к пенициллину и тетрациклину. Эти гены были перенесены из R-плазмид (рис. 7.3) в фрагмент небольшой плазмиды рМВ1, которая близка кочень хорошо изученной небольшой плазмиде ColEl. 
Плазмиды pBR322 и ColEl могут реплицироваться в Е. со-U и близких видах Enterobacteriaceae. В бактериальных клетках они представлены несколькими копиями; так,для ColEl число плазмидных копий на хромосому равно примерно 20, а для pBR322 — 40. Это обстоятельство очень важно для клонирования. Чем больше число копий клонированного гена, тем выше выход кодируемого белка. Кроме того, многокопийные плазмиды не так легко утрачиваются при культивировании. С другой; стороны, малое число копий плазмиды иногда имеет свои преимущества, например при клонировании таких генов, продукты которых гибельны для бактериальной клетки в большом количестве. 
Изучению механизмов контроля репликации и числа копий бактериальных плазмид посвящено множество работ. Было обнаружено, что число копий плазмид примерно одинаково в-клетках, размножающихся с разной скоростью. Из этого следует, что репликация плазмид как-то связана с ростом бактерий. Такая координация достигается при участии механизмов,, контролирующих начало репликации. Если уж репликация началась, то она идет с относительно постоянной скоростью при; любом темпе размножения бактерий. При высокой скорости размножения репликация индуцируется чаще в случае много-копийных плазмад, чем малокопийных. 
Начало репликации ColEl и pBR322 контролируется небольшими молекулами РНК, которые взаимодействуют с особым участком плазмиды, расположенным поблизости от точки инициации репликации. Начавшись, репликация идет в одном направлении и заканчивается вблизи точки инициации. Генетики,, стремящиеся максимально увеличить выход белков, кодируемых клонированными в pBR322 генами, получали мутанты с модифицированными РНК. У некоторых таких мутантов числа копий плазмиды составляет более 100, что приводит к существенному увеличению выхода продуктов, кодируемых клонированными генами. Интересная особенность репликации ColEl и pBR322 заключается в том, что она полностью обеспечивается ферментами хозяина. Сами плазмиды не несут информации, нужной для кодирования ферментов репликации. 
Процессы репликации pBR322 и ColEl, с одной стороны, и хромосомы Е. coli — с другой, различаются тем, что первый не подавляется хлорамфениколом, который блокирует синтез белка. В присутствии этого соединения репликация хромосом прекращается по завершении уже начавшегося раунда репликации. Такого подавления репликации pBR322 не происходит, и; плазмиды накапливаются в обработанных хлорамфениколом; 
клетках, так что в конечном счете они составляют до 50% всей ДНК- При выделении плазмид для увеличения выхода плаз-мидной ДНК к культуре за несколько часов до сбора клеток иногда добавляют хлорамфеникол. 
Инициация репликации плазмиды Rl E. coli регулируется белком-репрессором, кодируемым одним из генов R1. Были получены мутантные плазмиды, которые кодируют аномальный репрессор или же имеют несовершенный механизм-регуляции его образования. Некоторые из этих мутантов -т— температуро-чувствительные (репрессор неактивен при 43 °С). При 30 °С репликация идет нормально, и на клетку образуется 1—2 плаз-мидные копии, а при 43 °С репликация инициируется гораздо чаще, так что в клетке накапливается по нескольку сот плазмид. Небольшой сегмент R1, содержащий участок начала репликации и связанные с ними регулирующие элементы, был использован для создания плазмид-векторов, применяемых при клонировании разнообразных генов. -Преимущество таких векторов заключается в том, что при повышенной температуре с их помощью можно получать множества копий клонируемого гена, а следовательно, и много белка, кодируемого этим геном.