Автор работы: Пользователь скрыл имя, 14 Мая 2012 в 04:51, доклад
Существует огромное количество факторов негативно влияющих на биологические объекты. Одним из этих факторов является, ультрафиолетовое излучение. При воздействии на живые организмы большая его часть поглощается верхними слоями тканей растений или кожи человека и животных. В основе биологического действия ультрафиолетового излучения лежат химические изменения молекул биополимеров. Эти изменения вызываются как непосредственным поглощением ими квантов излучения, так и (в меньшей степени) образующимися при облучении радикалами воды и др. низкомолекулярных соединений.
Тема: Фотохимические превращения ДНК. Люминесцентные метки и зонды и их применение в биологии и медицине.
Существует огромное количество факторов негативно влияющих на биологические объекты. Одним из этих факторов является, ультрафиолетовое излучение. При воздействии на живые организмы большая его часть поглощается верхними слоями тканей растений или кожи человека и животных. В основе биологического действия ультрафиолетового излучения лежат химические изменения молекул биополимеров. Эти изменения вызываются как непосредственным поглощением ими квантов излучения, так и (в меньшей степени) образующимися при облучении радикалами воды и др. низкомолекулярных соединений.
На человека и животных малые дозы ультрафиолетового излучения оказывают оказывают благотворное действие — способствуют образованию витаминов группы D (Кальциферолы — образуются в результате воздействия ультрафиолетового излучения на эргостерин и дегидрохолестерин в результате облучения их ультрафиолетовыми лучами ) , улучшают иммунобиологические свойства организма. Характерной реакцией кожи на ультрафиолетовое излучение является — эритема (Эритема (от греч. erýthema - краснота), покраснение кожи, обусловленное расширением ее сосудов. .). Более длительно существует эритема воспалительного характера, которая появляется при воздействии химических веществ, физических факторов (трение, тепло, холод, ультрафиолетовое облучение и др.,) Максимальным эритемным действием обладает ультрафиолетовое излучение при избытке которого образуется защитная пигментация она же (загар). Большие дозы ультрафиолетового излучения могут вызывать повреждения глаз (фотоофтальмию) и ожог кожи. Частые и чрезмерные дозы излучения в некоторых случаях могут оказывать канцерогенное действие на кожу.
Так же ультрафиолетовое излучение является природным мутагеном, вызывая зачастую необратимые процессы в клетке (как растительной так и животной) наиболее эффективно с этим справляется излучение l в пределах 280—240 нм). Обычно его спектр летального и мутагенного действия примерно совпадает со спектром поглощения нуклеиновых кислот— ДНК и РНК, в некоторых случаях спектр биологического действия близок к спектру поглощения. Основная роль в действии ультрафиолетового излучения на клетки принадлежит, по-видимому, химическим изменениям ДНК: входящие в её состав пиримидиновые основания (главным образом тимин) так как при поглощении квантов ультрафиолетового излучения образуют димеры (Димер - дефект ДНК, возникающий в результате образования ковалентной связи между двумя соседними пиримидиновыми основаниями (тимидином или цитозином) под действием ультрафиолетовых лучей. Ультрафиолетовые лучи вызывают разрыв двойной связи и образование в этом месте ковалентной связи между двумя нуклеотидами Образование димера приводит к нарушению транскрипции ДНК на данном участке и возникновению мутаций. Образование димеров является главной причиной возникновения меланомы у человека.) , которые препятствуют нормальному удвоению репликации ДНК при подготовке клетки к делению. Это может приводить к гибели клеток или изменению их наследственных свойств мутациям. Определённое значение в летальном действии ультрафиолетового излучения на клетки имеют также повреждение биологических мембран и нарушение синтеза различных компонентов мембран и клеточной оболочки.
Большинство живых клеток может восстанавливаться от вызываемых излучением повреждений благодаря наличию у них систем репарации. Способность восстанавливаться от повреждений, вызываемых Ультрафиолетовым излучением, возникла, вероятно, на ранних этапах эволюции и играла важную роль в выживании первичных организмов, подвергавшихся интенсивному солнечному ультрафиолетовому облучению.
По чувствительности к Ультрафиолетовому излучению биологические объекты различаются очень сильно. Например, доза Ультрафиолетового излучения, вызывающая гибель 90% клеток, для разных штаммов кишечной палочки равна 10, 100 и 800 эрг/мм2, а для бактерий Micrococcus radiodurans — 7000 эрг/мм2 . Чувствительность клеток к излучение в большой степени зависит также от их физиологического состояния и условий культивирования до и после облучения (температура, состав питательной среды и др.). Сильно влияют на чувствительность клеток к Ультрафиолетовому излучению мутации некоторых генов. У бактерий и дрожжей известно около 20 генов, мутации которых повышают чувствительность к ультрафиолетовому излучению. В ряде случаев такие гены ответственны за восстановление клеток от лучевых повреждений. Мутации других генов нарушают синтез белка и строение клеточных мембран, тем самым повышая радиочувствительность негенетических компонентов клетки. Мутации, повышающие чувствительность к ультрафиолетовому излучению, известны и у высших организмов, в том числе у человека. Так, наследственное заболевание — пигментная ксеродерма обусловлено мутациями генов, контролирующих темновую репарацию.
Генетические последствия облучения ультрафиолетовое облучение пыльцы высших растений, клеток растений и животных, а также микроорганизмов выражаются в повышении частот мутирования генов, хромосом и плазмид. Частота мутирования отдельных генов, при действии высоких доз ультрафиолетового излучения, может повышаться в тысячи раз по сравнению с естественным уровнем и достигает нескольких процентов. В отличие от генетического действия ионизирующих излучений, мутации генов под влиянием ультрафиолетового излучения возникают относительно чаще, чем мутации хромосом. Благодаря сильному мутагенному эффекту ультрафиолетовое излучение широко используют как в генетических исследованиях, так и в селекции растений и промышленных микроорганизмов, являющихся продуцентами антибиотиков, аминокислот, витаминов и белковой биомассы. Генетическое действие ультрафиолетового излучения могло играть существенную роль в эволюции живых организмов.
Одним из наиболее эффективных дополнительных методов контроля гомеостаза живых систем является флуоресцентный метод. Флуоресценция – это испускание, происходящее при возвращении спаренного электрона на более низкую орбиталь. Спектр испускания вещества представляет собой зависимость интенсивности испускания от длины волны при фиксированной длине волны возбуждения света
Методы исследования флуоресценции конкретных веществ обладают высокой чувствительностью, а также удобным временным диапазоном, так как испускание флуоресценции происходит через 10-8 с (10 нс) после поглощения света. За это время происходит множество различных молекулярных процессов, которые влияют на спектральные характеристики флуоресцирующего соединения. В настоящее время созданы приборы, позволяющие измерять флуоресценцию 10-18 с зонда в живой клетке за время около 10-5 с, что намного превосходит чувствительность и быстродействие даже таких чувствительных методов, как радиоизотопный и иммуноферментный. Кроме того, исследование флуоресценции позволяет получить информацию о состоянии живых систем, не повреждая их, и не требует большого количества биологического материала. Имея такие преимущества, флуоресцентные методы позволяют просто и экономично решить многие задачи клинической диагностики, экологического контроля и физико-химического анализа и все шире применяются в медицинских и биохимических исследованиях.
Многие молекулы биологических веществ являются природными или естественными флуорофорами, т. е. веществами, способными флуоресцировать в определенном диапазоне длин волн при соответствующих условиях возбуждения, например белки. Установлено, что флуоресцировать в белках способны только ароматические аминокислоты, обладающие системой сопряженных двойных связей . Основным флуоресцирующим компонентом в них является триптофан, который обусловливает около 90% всей белковой флуоресценции.
Стоит заметить что все наработки в данной области нашли свое применение в изучении биолюминесценции. Биолюминесценция – это явление излучения света живым организмом. Светятся кораллы, светлячки, медузы, черви, грибы. Это очень непохожие организмы, представляющие разные царства природы. Таксономическое (
Если взять плакат с нанесенным на него эволюционным древом всех живых организмов – и животных, и растений, и грибов, и бактерий – и плеснуть на него краской, то это примерно покажет распределение по древу светящихся существ.
Сообразно этому непохожими являются и механизмы люминесценции. По современным оценкам, у явления биолюминесценции существует до 30 разных биохимических механизмов. Из этих 30 механизмов Симомуре удалось расшифровать четыре, а всего расшифровано шесть. Таким образом, связи между светящимися организмами нет ни в систематическом, ни в биохимическом плане, а биологический механизм этого явления известен лишь на 15–20%.
Сама по себе люминесценция – свечение – представляет собой форму выделения энергии при химической реакции – окислении. Но так как эта реакция биохимическая, в ней кроме окислителя (кислорода) и восстановителя (субстрата) участвует и фермент, с помощью которого организм может управлять свечением.
Самый известный и подробно описанный случай биолюминесценции – зеленое свечение медузы Aequorea victoria, изучение которого и принесло Симомуре Нобелевскую премию.
Здесь свечение еще сложнее: кроме фермента экворина в его возникновении задействован дополнительный белок – GFP (green fluorescent protein), который отвечает за собственно зеленое свечение, образуя комплекс с экворином. Есть взять отдельно экворин и кислород, то произойдет лишь вспышка синего цвета. Однако в организме медузы экворин образует комплекс с GFP, и между ними происходит безызлучательный перенос энергии. Квант синего света передается на GFP, тот его поглощает и излучает уже зеленый свет. Этот механизм детально изучен, однако, какова роль в природе этого явления, пока совершенно непонятно. Непонятно, ни зачем вообще медузе нужно излучать свет, ни почему свет зеленый, а не синий. Меж тем это сложно списать на случайность: самой медузе это стоит достаточно дорого, ведь продуцировать дополнительные белки в больших количествах весьма энергозатратно.
Следует отметить, что работы Симомуры по GFP были сделаны еще в 60-х годах. Он выделил GFP и охарактеризовал его, попытавшись также теми методами, которые были доступны в то время, определить структуру особой группы атомов, которая определяет цвет этого белка, – хромофора (греч. «несущий цвет»). Как понятно из самого слова «белки», обычно эти вещества белые, бесцветные. Малая часть из них – GFP и родственные ему – окрашены. Сейчас известно, что окраска возникает за счет того, что внутри молекулы белка происходит химическая реакция, которая катализируется им самим. То есть обычно белок катализирует взаимодействие других веществ, а в данном случае – реакцию внутри себя. Белок имеет форму бочонка, в самой середине которого находятся три аминокислоты, которые реагируют между собой, образуя хромофор. Причем в данном случае хромофор способен не только поглощать свет определенной длины волны (то есть приобретать цвет), но и излучать его (то есть светиться).
Первоначально работы Симомуры не стали сенсацией, и GFP какое-то время был не более чем интересным казусом. Однако затем получили большое развитие методы генной инженерии и молекулярной биологии. При помощи этих методов удалось секвенировать GFP, то есть получить его аминокислотную последовательность, затем перевести ее в последовательность ДНК, которая его кодирует, затем найти эту последовательность методом ПЦР (полимеразной цепной реакции) в медузе. Оказалось, что флуоресцентное свечение медузы совершенно уникально: оно кодируется всего одним геном. Такая простота позволила клонировать этот ген и искусственно наделять этим признаком клетки и живые организмы, встраивая ген в их ДНК. То есть
ген медузы удается встроить в бактерию, которая считывает этот ген, продуцирует нужные белки, в том числе GFP, и начинает флуоресцировать.
То же проделали и с червями-нематодами, четко подтвердив, что фенотипический, внешний признак флуоресценции может быть закодирован всего одним геном. Это уже вызвало настоящий взрыв интереса к GFP как перспективной биохимической метке. Флуоресценцию можно наблюдать или невооруженным глазом, или с помощью флуоресцентных микроскопов, и, когда такой легко наблюдаемый признак кодируется всего одним геном, его можно передать почти любому организму. Клонировать один ген проще, чем десять генов. Так примерно через 25 лет после открытия GFP оказалось, что это очень полезная вещь. Сейчас существуют сотни различных методик его применения. Все они сводятся к тому, чтобы с помощью флуоресценции наблюдать различные явления, которые происходят в клетках или целых организмах: экспрессию генов, развитие тканей, стволовых клеток, поведение раковых опухолей, взаимодействие белков друг с другом, судьбу клеточных органелл. Например,
помещенная в испытуемый организм раковая или стволовая клетка уже не сможет«замешаться в толпе» – она будет видна, где бы она ни оказалась.
Более того, ее «потомство», когда она начнет размножаться, также будет носителем «гена светимости», и медики могут проследить всю возникающую «популяцию». Кстати,
флуоресцирующие аквариумные рыбки – это тоже результат клонирования GFP, в природе их не существует.
Флуоресцентная метка – это как бы ярлык, который можно «прикрепить» к чему угодно в клетке или организме. Вслед за этим становится удобно наблюдать, что происходит с помеченным объектом. Особенно востребованы белки с дальне-красным спектром, потому что в этой области живые ткани прозрачны даже у млекопитающих. Таким образом можно просвечивать насквозь живой организм и видеть опухоль внутри него. То есть опухоль, клетки которой генетически модифицированы так, что флуоресцируют в этой области спектра, помещают в испытуемое животное, а затем в живом организме визуально наблюдают развитие опухоли и её реакцию, например, на химиотерапию. Другой вариант – в эмбрионе на стадии, когда клетки еще не специализированы, помечают определенную их часть и смотрят, какие клетки из них получились, какие ткани развились. Это не так просто сделать обычными способами: стандартные биохимические методы окрашивания требуют многократных манипуляций, в результате которых результат наблюдается часто недостаточно четко.
Еще раз подчеркнем, что особенность GFP в том, что его вводят не извне, с помощью инъекции, как некоторые другие флуоресцентные метки, а изначально кодируют в геноме клетки или организма. В том числе это позволяет изучать и функционирование самого генома, а это очень непростая задача даже сейчас. Хотя уже достаточно легко можно «прочитать» геном, все еще не так легко понять «смысл прочитанного»: как геном работает, каков механизм реализации генетической информации в виде признаков в самом организме. Сейчас этим занимается новая область – функциональная геномика, которая активно пользуется возможностями клонирования GFP.
Желтый, красный, голубой
В 1999 году Сергей Лукьянов (ныне академик РАН) начал поиски в природе белков, похожих на GFP. Поиски увенчались успехом: сначала белки, аналогичные GFP, были найдены в цветных кораллах, хорошо знакомых любителям дайвинга в Красном море. И вот только недавно, около 10 лет назад, стало известно, что вся эта многообразная красота обусловлена именно наличием подобных GFP белков. Однако
если GFP излучает только зеленый свет, то белки, найденные в кораллах, оказались самых разных цветов.
При этом все они, так же как и GFP, кодируются всего одним геном. Это привнесло дополнительные возможности для использования флуоресцентных меток в геноме: так как «ярлыки» стали многоцветными, их арсенал расширился. То есть сегодня с их помощью можно наблюдать уже три-четыре объекта одновременно. Плюс можно наблюдать взаимодействие белков друг с другом в пространстве за счет переноса энергии, то есть по изменению цвета можно видеть сближение белков. В нашей лаборатории продолжается поиск новых флуоресцентных белков и способов их применения. В ходе этого поиска, в частности, были найдены белки, светимость которых можно переключать с помощью света разной длины волны (то есть разного цвета). Под воздействием одного света они флуоресцируют, другого – перестают. Это новая возможность – включать и выключать метку.
Флуоресцентные метки – химические и генетические – заменили популярные раньше в биохимии и молекулярной биологии изотопные метки.
Флуоресцентные краски безопаснее, дешевле, лучше хранятся. Уже сейчас это огромный рынок, и в молекулярной биологии всегда есть запрос на новые красители с новыми свойствами.
Вместо сердца пламенный хромофор
Другая важная задача состояла в том, чтобы выяснить, почему белки, похожие на GFP, светятся разными цветами. Оказалось, что у них разные химические структуры хромофоров. Область химии, связанная с изучением хромофоров светящихся белков, сводится к двум вопросам – какова их структура и как они получаются в природе. Понять, какой именно хромофор в белке, не всегда можно даже с помощью рентгеноструктурного исследования:
на фоне огромной молекулы в десятки тысяч атомов непросто точно установить даже состав, не говоря уже о пространственной структуре маленького заместителя.
А зачастую именно такие тонкие эффекты определяют все явление флуоресценции. Чтобы разрешить этот вопрос, хромофоры можно синтезировать искусственно. Сопоставляя данные различных методов, устанавливают, какая же именно группа атомов отвечает за флуоресценцию и цвет того или иного белка. Синтез хромофоров зачастую дает ответы на вопросы об их работе, которые нельзя получить, изучая целый белок. Маленький его кусочек, модельное соединение, очень много могут сказать о процессе флуоресценции.
Наша последняя работа, связанная с синтезом хромофоров, позволила разгадать загадку хромофора самого GFP – родоначальника светящихся белков. Она состоит в том, что,
когда этот маленький «кирпичик» находится в составе белка, он является очень яркой флуоресцентной краской, однако сам по себе синтетический аналог, полностью повторяющий структуру природного хромофора, находясь в растворе, почти не флуоресцирует.
Мы выяснили, что дело здесь как раз в пространственной структуре – взаимном расположении атомов. В белке она зафиксирована, «зажата» соседними аминокислотами, а в растворе она свободна и изгибается так, что теряет флуоресцентные свойства. Однако если ввести дополнительный элемент жесткости, ограничивающий вращение молекулы, флуоресценция возникает примерно на том же высоком уровне, который характерен для белка. Таким образом на основе природной структуры мы получили в свое распоряжение новый перспективный флуоресцентный краситель, который, как мы надеемся, найдет практическое применение.