В качестве объектов для биотестирования  применяются разнообразные тест-организмы - подопытные биологические объекты, подвергающиеся воздействию определенных доз или концентраций ядов, вызывающих у ни тот или иной токсический эффект, который регистрируется и оценивается в эксперименте [3].Это могут быть бактерии, водоросли, беспозвоночные, а так же позвоночные животные. Каждый из объектов имеет свои специфические преимущества и заслуживает внимания, поскольку ни один организм не может служить универсальным тест-объектом, одинаково чувствительным ко всем загрязняющим веществам [21]. Для гарантированного выявления присутствия в природных водах токсического агента известного химического состава должен использоваться набор объектов, представляющих различные группы водного сообщества. Оптимальной может быть система, включающая в качестве тест-объектов по одному виду водных растений, беспозвоночных и рыб (всего 3-5 видов), состояние которых оценивается по параметрам, относящихся к разным уровням интегральности [27].

       Различают острые и хронические биотесты. Первые рассчитаны на получение экспресс – информации о токсичности исследуемого вещества для данного тест – организма, вторые – на выявления долговременного эффекта действия токсикантов, в частности малых и ультра малых концентраций. Острые опыты проводятся в различные сроки: от  нескольких минут до 96 часов. В результате проведенных опытов учитывается величина выживаемости, т.е. статистически достоверный процент выживаемых или гибнущих особей за определенное время при определенной концентрации вещества [4].

       Острые  опыты позволяют достаточно оперативно выяснить, оказывает ли данное вещество на исследуемую тест-функцию у данного тест-организма. На их основе можно установить интенсивность угнетения тест-функции за определенное время и развития этого процесса во времени, определить широту спектра действия токсиканта или наличие у него избирательной токсичности отдельных видов [16].

       Таким образом, биологические методы тестирования являются группой высокочувствительных методов анализа и выгодно отличаются своей простотой, сравнительной неприхотливостью к лабораторным условиям, дешевизной и универсальностью.

1.6. Физиология Daphnia magna

    Действие  токсических веществ в определенной степени зависит от особенностей жизнедеятельности тест-организма, его жизненного цикла, морфологии и  физиологии.

    Короткий биологический цикл развития позволяет проследить рост и развитие дафний на всех жизненных стадиях. При благоприятных условиях в лаборатории дафнии большую часть года размножаются партеногенетическим способом. При  недостатке пищи, перенаселенности, изменении температурных условий и уменьшении светового дня в популяции дафний появляются самцы и они переходят к половому размножению [7].

    Дафнии  – типичные пресноводные формы. Приуроченность к жизни в пресной воде связано  с очень слабой способностью этих рачков регулировать внутреннее осмотическое давление. Дафнии весьма устойчивы к понижению концентрации солей крови  и могут жить достаточно долго в дистиллированной воде, не получая пищи. [7]. Кроме того, рачки дафний устойчивы к изменениям кислородного режима [27].

    Помимо  прочих факторов оказывающих заметное влияние на поведение и жизнедеятельность дафний, можно выделить освещение. Свет дафниям необходим для нормального протекания некоторых процессов обмена веществ. Так, например, синтез каротиноидов, входящих в состав тела рачков и их яиц, происходит лишь на свету. Известно, что отношение дафний к свету может быть  изменено под влиянием температуры. Положительное отношение к свету проявляют рачки при высокой температуре и значительном освещение или при низкой температуре и затемнении. В тех случаях, когда имеется сочетание света с низкой температурой или темноты с высокой температурой, дафнии становятся отрицательно фототоксичными [8].

    Дафнии  являются фильтраторами. Отцеживание взвешенных в воде частиц осуществляется при помощи туловищных ножек, которые, полностью утратив роль органов движения, строго дифференцированы для несения определенных функций. [27].

      Вместе  с тем дафнии являются одним из лучших тест – организмов, жизнь  их не долгая и разведение синхронных культур в лабораторных условиях, не составляет труда. Так же дафнии, при жизни в пресной воде, хорошо реагируют на различные примеси в природных водоемах или в лабораторных растворах и в связи с этим широко используются в биотестировании [10]. 

      Таким образом для опытов в качестве тест – организмов были выбраны ветвистоусые рачки вида Daphnia magna. В экспериментах нам предстояло оценить целесообразность использования методов оценки токсичности воды по выживаемости и реакции всплытия рачков, в зависимости от концентрации нефти и нефтепродуктов. В качестве токсикантов, было решено взять сырую нефть, дизельное топливо и бензин марок АИ80, АИ92 и АИ 95.

 

2. Объект и методы исследования

      В качестве тест-объектов в работе использовались ветвистоусые рачки вида Daphnia magna. Их систематическое положение следующее:

Тип  Arthropoda

П/тип  Branchiopoda

Отряд Phillopoda

П/отряд Cladocera

Семейство Daphniida 

    Оценка  действия нефтепродуктов на выживаемость дафний проводилась согласно методике определения токсичности водных вытяжек из почв, осадков сточных вод и отходов, питьевой, сточной, природной воды по смертности тест-объекта Daphnia magna Straus [31].

    Эксперименты  по определению чувствительности дафний к нефтепродуктам в зависимости от концентрации и времени экспонирования производились в сравнении с контрольными пробами.

    Для экспериментов готовились растворы с различными концентрациями токсикантов, представленными в таблице 1.

    Для приготовления суспензии в 200 мл отстоянной водопроводной воды добавляли 2 мл токсиканта, для получения максимальной концентрации 10 мл/л, и  тщательно перемешали в течение одного часа, в качестве устройства для перемешивания использовалось устройство для выращивания водоросли хлореллы КВ-05, с отключенным светом и затем интенсивно встряхивали руками около 5 минут.

    Для приготовления водорастворимой фракции, перемешивали в течении 3 часов в КВ-05, затем переливали водную эмульсию в делительный цилиндр, отстаивали в течении 20 минут и сливали через кран слой водного раствора, находящийся под маслянистой пленкой, которая в итоге оставалась в цилиндре.  
 

Таблица 1 - Концентрации токсикантов в тестируемых растворах.

 

    Затем проводили ряд десятикратных  разбавлений по схеме указанной  на рисунке 1. 

 
 
 

Рисунок 1 - Схема десятикратного разбавления суспензии токсиканта.

    Далее в стеклянные флаконы наливали по 50 мл испытуемых растворов, по три флакона на каждую концентрацию и три флакона в качестве контроля, т.е. в эксперименте было задействовано 18 флаконов. Затем в каждый флакон помещали по десять особей рачков Daphnia magna. Для проведения биотестирования использовались особи в возрасте 24 часа, для чего предварительно осуществлялось синхронизированное выращивание культуры рачков одинакового возраста.

    Флаконы с пробами воды и тест-организмами экспонировались в устройстве для экспонирования рачков УЭР-03 в течение двух суток, в климатостате Р2. Для экспонирования дафний использовался отдельный климатостат, для того что бы маточная и синхронизированная культуры не пострадали от токсического действия паров нефтепродуктов.

    Показания смертности и всплытия снимались через 48 часов после помещения тест – организмов в испытуемые растворы. Количество кислорода измерялось сразу после приготовления суспензий и через 48 часов.

    Обработка результатов производилась в пакете Microsoft Office Excel 2007.

 

3. Результаты и их обсуждение

3.1. Оценка токсичности сырой нефти по выживаемости и всплытию дафний

    Для решения первой задачи была приготовлена водная эмульсия сырой нефти, с концентрациями в диапазоне от 10 до 0,001 мл/л. Рачки экспонировались в течении 48 часов, после чего подсчитывалось количество живых и всплывших особей. Количество кислорода измерялось в начале постановки эксперимента и через 48 часов. Результаты представлены на рисунках 2-3.

     Рисунок 2 - Выживаемость и всплытие рачков Daphnia magna в зависимости от концентрации сырой нефти в водной эмульсии.

 

     Рисунок 3 - Количество кислорода в зависимости от концентрации сырой нефти в водной эмульсии.

     При исследовании токсичности водных эмульсий сырой нефти (рис. 2) было выявлено, что максимальная концентрация (10 мл/л) вызывала 100% смертность тест-организмов. Концентрация, вызывающая смертность 50 % тест-организмов находилась в диапазоне от 0,01 мл/л до 0,1 мл/л, а в наименьшей исследуемой концентрации токсиканта (0,001 мл/л) наблюдалась смертность дафний на уровне 35%.

    При этом всплытие всех дафний наблюдалось даже при минимальной концентрации нефти в растворе.

    Количество  кислорода (рис. 3) в водной эмульсии нефти с ростом ее концентрации монотонно снижалось. Так же четко видно, что во всех исследованных пробах кислород снижался не больше, чем на 20 %, а разница содержания кислорода в начале постановки эксперимента и через 48 часов меняется незначительно. Из литературных источников известно, что такое изменение концентрации кислорода в воде не может быть губительным для дафний или вызывать их массовое всплытие к поверхности раствора. Летальный уровень содержания кислорода в воде для рачков составляет в среднем менее 35 % [30] .Это позволяет нам сделать предположение, что скорей всего всплытие происходит из-за залипания дафний в поверхностной маслянистой пленке, в результате чего дафнии лишаются возможности двигаться и дышать.

     Рисунок 4 - Выживаемость и всплытие рачков Daphnia magna в зависимости от степени разведения водорастворимой фракции нефти.

     Рисунок 5 - Количество кислорода в зависимости от степени разведения водорастворимой фракции нефти.

    Для того, чтобы исключить действие маслянистой пленки на дафний, было решено провести опыт с водорастворимой фракцией нефти.

     Результаты проведенных экспериментов показали, что в водорастворимой фракции нефти только при минимальном разведении выживаемость (рис. 4) снижалась на 15%, в сравнении с контролем, и только в этой концентрации наблюдалось незначительное всплытие тест-организмов. При больших разведениях достоверных изменений выживаемости и всплытия рачков относительно контроля зарегистрировано не было.

     При этом количество кислорода во всех разведениях водорастворимой фракции нефти снижалось не менее, чем на 5% и практически не изменялось к концу эксперимента.

     Таким образом, можно сделать вывод, что  причиной гибели рачков при загрязнении водной среды сырой нефтью в большей степени является их залипание в поверхностной маслянистой пленке (физическое воздействие), а не токсичность составляющих ее компонентов.

 

     

3.2.Оценка токсичности нефтепродуктов по выживаемости и всплытию дафний

       В следующей серии экспериментов  перед нами стояла задача исследовать  токсическое действие нефтепродуктов, а именно бензина марок АИ 80, АИ 92, АИ 95 и дизельного топлива на выживаемость и всплытие тест-организмов. Как и в предыдущих опытах, количество кислорода измеряли в момент постановки эксперимента и через 48 часов. Результаты представлены на рисунках 6-13.