Микробная биодеградация ксенобиотиков и токсикантов

     1) ни один из них не может разрушать все органические соединения;

     2) некоторые органические соединения  в высокой концентрации подавляют функционирование или рост деградирующих их микроорганизмов;

     3) большинство очагов загрязнения содержит смесь химикатов, и микроорганизм, способный разрушать один или несколько ее компонентов, может инактивироваться другими компонентами;

     4) многие неполярные соединения адсорбируются частицами почвы и становятся менее доступными;

     5) биодеградация органических соединений часто происходит довольно медленно. Часть этих проблем можно решить, осуществив конъюгационный перенос плазмид, которые кодируют ферменты разных катаболических путей, в один реципиентный штамм (рис.7). Если две плазмиды содержат гомологичные участки, то между ними может про изойти рекомбинация с образованием гибридной плазмиды, которая имеет больший размер и обладает свойствами исходных плазмид. Если же две плазмиды не содержат гомологичных участков и относятся к разным группам несовместимости, то они могут сосуществовать в одной бактерии [5].

Рис. 7. Создание бактериального штамма, способного разрушать камфару, октан, ксилол и нафталин. Штамм А, несущий плазмиду САМ (она детерминирует разрушение камфары), скрещивают со штаммом В, несущим плазмиду ОСТ (разрушение октана). При этом образуется штамм Е, который содержит гибридную плазмиду, образовавшуюся в результате гомологической рекомбинации между исходными плазмидами и обладающую функциями каждой из них. Штамм С, содержащий плазмиду XYL (разрушение ксилола), скрещивают со штаммом D, содержащим плазмиду NAH (разрушение нафталина), и получают штамм F, который несет обе плазмиды. Наконец, скрещивают штаммы Е и F, в результате чего образуется штамм G, содержащий плазмиды САМ/ОСТ, XYL и NAH. 
 

1. Перенос плазмид

     Большинство разрушающих ксенобиотики бактерий, модифицированных путем  переноса плазмид, являются мезофильными  микроорганизмами (хорошо растут при 20-40⁰С), а температура воды в загрязненных реках, озерах и океанах обычно лежит в диапазоне от 0 до 20⁰С. Чтобы проверить, можно ли создать бактерию, обладающую более широкими катаболическими возможностями и в то же время способную расти и развиваться при низких температурах, плазмиду TOL (детерминирует разрушение толуола) мезофильного штамма Pseudomonas putida перенесли с помощью конъюгации в психрофильный (с низким температурным оптимумом) штамм, утилизирующий салицилат при температуре, близко к 0^0С. Трансформированный штамм содержал введенную в него плазмиду TOL и собственную плазмиду SAL, детерминирующую разрушение салицилата, и был способен утилизировать как салицилат, так и толуол в качестве единственного источника углерода при ОХ. Психрофильный штамм дикого типа (нетрансформированный) не мог расти при любой температуре, если единственным источником углерода, был толуол (толуат). Эта работа показала принципиальную возможность создания психрофильных штаммов бактерий, эффективно разрушающих ксенобиотики в природных условиях, но для их реального получения необходимо провести дополнительные исследования [5]. 

2. Изменение генов

     Объединение разных метаболических путей в одном микроорганизме с помощью конъюгации - это лишь один из способов создания бактерий с новыми свойствами. Расширить их катаболические возможности можно и другим путем, модифицируя гены, кодирующие ферменты того или иного метаболического пути. Осуществимость этого подхода проверяли на примере плазмиды pWWO, 12 генов которой кодируют мета-расщепление толуола и ксилола. Обладающие этой плазмидой псевдомонады могут использовать в качестве источника углерода алкилбензоаты [5].

     Детальный биохимический и генетический анализ показал, что несущие pWWO-плазмиду бактерии могут расщеплять 4-этилбензоат только до 4-этилкатсхола, который инактивирует один из основных ферментов данного метаболического пути, катехол-2,3-диоксигеназу, являющуюся продуктом гена xylE, и поэтому не разрушается и накапливается в среде. Кроме того, 4-этилбензоат, в отличие от остальных алкилбензоатов, не активирует XylS-белок; поэтому, если он является единственным субстратом, хуl-оперон не транскрибируется. Для усовершенствования природной системы летиорасщепления алкилбензоатов необходимо решить две основные задачи:

     1) предотвратить инактивацию катеход-2,3-диоксигеназы 4-этил-бензоатом;

     2) индуцировать транскрипцию генов хуl -оперона в том случае, если единственным субстратом является 4-этилбензоат[5].

     Для решения второй задачи был проведен поиск мутантной плазмиды. Для этого в плазмиду, несущую ген устойчивости к ампициллину, встроили ген устойчивости к тетрациклину, находящийся под контролем Р_т-промотора. В другую плазмиду, несущую ген устойчивости к канамицину, встроили ген xylS. Полученными конструкциями трансформировали E. coli, отобрали клетки, содержащие обе плазмиды, по признаку устойчивости к ампициллину и канамицину (рис. 8, А), обработали их мутагеном этилметансульфонатом и вырастили на среде, содержащей тетрациклин и 4-этилбензоат. Растущие на этой среде клетки содержат мутантный ген xylS и продуцируют измененный XylS-белок (S*), который способен взаимодействовать с 4-этилбензоатом и активировать транскрипцию гена устойчивости к тетрациклину. Чтобы решить проблему инактивации катехол - 2,3 -диоксигеназы, мутантный ген xylS встроили в плазмиду с широким кругом хозяев, несущую ген устойчивости к канамицину, и ввели ее в клетки P. putida, содержащие плазмиду pWWO (рис. 8, Б). Трансформированные клетки высеяли с высокой плотностью на чашки с минимальной средой, содержащей 4-этилбензоат в качестве единственного источника углерода, канамицин для отбора клеток с плазмидой и этилметансульфонат. Клетки, растущие на этой среде, вырабатывают измененную катехол-2,3-диоксигеназу, которая не ингибируется 4-этил-катехолом. Дополнительный анализ подтвердил, что в гене катехол-2,3-диоксигеназы pWWO действительно произошла мутация и что два мутантных гена обеспечивают расщепление 4-этилбензоата [5].

     Оба модифицированных гена участвуют в  процессе деградации всех субстратов данного метаболического пути. Поэтому  стратегия, использованная для повышения  эффективности расщепления 4-этилбензоата, применима и в случае других соединений. Таким образом, проведенная работа показывает, что вполне реально усовершенствование того или иного катаболического пути с помощью технологии рекомбинантных ДНК, традиционного мутагенеза и соответствующих методов отбора [5].

Рис.8, А. Создание  системы синтеза белка XylS-белка, активируемого 4-этилбензоатом

Рис.8, Б. Создание системы синтеза  модифицированной катехол-2,3-дикосигеназы, которая не ингибируется 4-этилкатехолом 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

4.МЕХАНИЗМЫ УСКОРЕНИЯ БИОДЕГРАДАЦИИ  ПОЛЛЮТАНТОВ В ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЕ 

     Биодеградация персистентных поллютантов в природе может длиться десятки лет, вызывая нарушение функционирования биоценозов. Бурное развитие экологической биотехнологии как науки и формирование рынка экологических биотехнологий в развитых странах вселяют некоторый оптимизм относительно решения в будущем проблемы глобального загрязнения окружающей среды [6].

     Поскольку биодеградация загрязнителей осуществляется, в основном, в результате жизнедеятельности  бактерий и грибов, пополнение знаний о функционировании этих организмов позволяет разрабатывать новые  подходы к осуществлению ускоренной и более полной деградации ксенобиотиков [6].

     Уже традиционными стали технологии биоремедиации загрязненной почвы, основанные на стимуляции естественной деструктивной микрофлоры или интродукции высокоактивных штаммов микроорганизмов. Однако среди ученых не утихают споры по поводу экологической и коммерческой оправданности внесения чужеродных организмов в сформировавшиеся природные ценозы. Не вызывает сомнения необоснованность рекомендаций по повсеместному использованию нефтеокисляющих биопрепаратов. Более экологичными можно считать способы стимуляции аборигенных микроорганизмов in situ. Проведенные нами исследования и анализ многочисленных публикаций в ведущих научных изданиях показывают сопоставимость эффективности названных приемов. Что же касается стоимости, стимуляция имеет неоспоримые преимущества, хотя и в этом случае требуется строгий токсикологический контроль за состоянием ремедиируемого участка [6]..

     Последнее десятилетие характеризуется всплеском  развития фиторемедиации - технологии, основанной на использовании растений. Известно, что растительная ризосфера за счет ее насыщенности ассоциативными и симбиотическими микроорганизмами является зоной повышенной биохимической активности, что и служит причиной ускорения процессов биодеградации поллютантов в почве под растениями. Вместе с тем, фиторемедиация является эффективной, экономически выгодной и эстетически привлекательной технологией, наиболее принимаемой обществом. Однако по конечному результату она сопоставима с другими экологическими биотехнологиями [6].

     В научных публикациях последних  лет появилась новая зеленая  технология - трансгенная ремедиация, которую можно считать самым эффективным приемом очистки почвы на сегодняшний день. Использование трансгенных растений позволяет повысить деградацию поллютантов в сотни раз. Однако представляется маловероятным широкое использование этой технологии в обозримом будущем [6]. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 

     Биодеградация – это процесс разрушения микроорганизмами веществ, загрязняющих окружающую среду  [5].

     Микробная деградация играет существенную роль в процессах детоксикации устойчивых поллютантов, загрязняющих среду в результате деятельности человека. Особенно важное значение процессы микробной биоконверсии имеют при деградации галогенированных ксенобиотиков, для токсикации которых термальные и физико-химические методы непригодны, так как приводят к образованию более токсичных соединений типа диоксинов и бензофуранов [7].

     Многие  бактерии рода Pseudomonas несут плазмиды, кодирующие ферменты, которые катализируют расщепление ароматических и галогенсодержащих органических соединений. В большинстве случаев одна плазмида содержит гены ферментов одного специфичного катаболического пути. Объединяя плазмиды разных штаммов в одном хозяине, можно создать организм, способный к деградации нескольких соединений. Кроме того, с помощью генетических манипуляций можно расширить спектр субстратов, разрушаемых с помощью определенного ферментативного пути [5].

     Полученные  результаты по изучению особенностей деградации ксенобиотиков, разработка способов интенсификации разложения поллютантов, возможность на основании полученных данных по пространственной структуре молекул методом направленного мутагенеза получать ферменты с заданной/измененной субстратной специфичностью позволяют создать высокоэффективные бактериальные или ферментные препараты для очистки территорий, а также оптимизировать процессы биоремедиации почв и очистки промышленных стоков, содержащих галогенированные поллютанты [7].

СПИСОК  ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Биодеградация серусодержащего полимера в процессе очистки сточных вод химических производств / Е.В.Перушкина [и др.] // Химическая промышленность сегодня. – 2008. - № 7. – с. 42-49. ISSN 0023 110Х
2. Волова, Т.Г. Биотехнология / Т.Г. Волова. – Новосибирск : Издательство Сибирского отделения РАН, 1999. – 252 с. ISBN 5-7692-0204-1
3. Саловарова, В.П. Введение в биохимическую экологию : учеб.пособие / В.П. Саловарова, А.А. Приставка, О.А. Берсенева. – Иркутск : Издательство Иркутского государственного университета, 2007. – 159 с. ISBN 978-5-9624-0224-6
4. Карасевич, Ю.Н. Основы селекции микроорганизмов, утилизирующих синтетические органические соединения / Ю.Н. Карасевич. – М. : наука, 2002. – 144 с. ISBN 5-76802-386-8
5. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение : [пер.с англ.] / Б. Глик, Дж. Пастернак. – М. : Мир, 2002. – 589 с., ил. ISBN 5-03-003328-9
6. Механизмы ускорения биодеградации поллютантов в окружающей среде [Текст] / О.В. Турковская // Международная научная конференция «Микроорганизмы и биосфера» : тезисы. – М. : ИНМИ РАН. – 2007 г. – Библиограф. : с. 130.
7. Физико-биохимические основы бактериальной деградации ксенобиотиков [Текст] / Л.А. Головлева [и др.] // Международная научная конференция «Микроорганизмы и биосфера» : тезисы. – М. : ИНМИ РАН. – 2007 г. – Библиограф. : с. 31.