Синтез нуклеиновых кислот и белков

СИНТЕЗ НУКЛЕИНОВЫХ  КИСЛОТ И БЕЛКОВ

Структура нуклеиновых  кислот

Нуклеиновые кислоты представляют линейные полимеры нуклеозидмонофосфатов, то есть полинуклеотиды. Нуклеотиды построены из трех компонентов: пиримидинового или пуринового основания, пентозы и фосфорной кислоты. Нуклеотиды связаны между собой в цепь фосфодиэфирной связью. Она образуется за счет этерификации ОН - группы С-З’ пентозы одного нуклеотида и ОН - группы фосфатного остатка другого нуклеотида. В результате один из концов полинуклеотидной цепи заканчивается свободным фосфатом (Р-конец или 5’-конец). На другом конце цепи имеется неэтерифицированная ОН - группа у С-З’ пентозы (З’ - конец).

Типичный нуклеотид (АМР)

Структура полинуклеотидной цепи

Первичная структура нуклеиновых кислот определяется как последовательность нуклеотидных остатков в полимерной цепи. Многообразие молекул DNA и RNA объясняется их первичной структурой. Как многие другие биополимеры, нуклеиновые кислоты имеют ещё и вторичную структуру, под которой понимают их пространственную организацию.

Вторичная структура 

DNA Молекула DNA представляет собой правозакрученную  спираль, состоящую из двух полинуклеотидных цепей с антипараллельным ходом. Это означает, что 3’-концу одной цепи соответствует 5’-конец другой цепи и наоборот.

Структура двойной спирали DNA

Остатки оснований  направлены внутрь спирали. На один виток  спирали приходится 10 пар оснований. Цепи DNA не идентичны, так как нуклеотидный состав их различен, однако первичная  структура одной цепи предопределяет нуклеотидную последовательность другой цепи, то есть они комплементарны друг другу. Это связано с существованием комплементарных пар оснований.

Комплементарные пары оснований. *СН₃-группа в тимине (Т) замещается на H в урациле (U).

Физико-химическую основу комплементарности  составляют водородные связи, которые  могут образоваться только между  аденином одной цепи и тимином другой, противоположно направленной цепи (пара А-Т), и аналогично между гуанином и цитозином (пара G-C). Вторичная структура RNA несколько иная. Молекула RNA состоит из одной полинуклеотидной цепи. Отдельные участки этой цепи (до 20-30 нуклеотидных пар) могут быть комплементарны между собой и образовывают спиральную структуру за счет связей между аденином и урацилом (пара A-U) и гуанином и цитозином (пара G-C). Между спирализованными участками располагаются одноцепочечные петли. Существует несколько разновидностей RNA: матричная (mRNA), транспортная (tRNA), рибосомная (rRNA). На рисунке приведена структура tRNA, у которой спирализованные участки определяют специфическую пространственную конформацию: фигуру «клеверного листа».

Трехмерная пространственная структура  транспортной RNA

Анимация трехмерной пространственной структуры транспортной RNA

tRNA имеет на 3’-конце ССА для  связывания аминокислоты, а в  средней части молекулы - антикодоновый  участок - последовательность нуклеотидов,  обеспечивающую взаимодействие tRNA с кодоном mRNA.

 

Денатурация и ренатурация DNA

Вторичная структура DNA стабилизируется  лишь слабыми водородными и гидрофобными связями, следовательно, DNA способна к  денатурации (плавлению) при повышении  температуры до 80-90^о и ренатурации при последующем охлаждении.

Денатурация и ренатурация DNA

При денатурации двухспиральная молекула DNA разделяется на отдельные цепи. Температура, при которой 50% DNA денатурировано, называется температурой плавления и зависит от качественного состава DNA. Так как пары G-C стабилизированы тремя водородными связями, а пары А-Т только двумя, то чем выше доля G-C пар, тем стабильнее молекула. При денатурации DNA поглощение света при длине волны 260 нм повышается (гиперхромный эффект), что позволяет легко контролировать состояние вторичной структуры DNA. Если раствор денатурированной DNA медленно охлаждать (отжиг), то вновь возникают слабые связи между комплементарными цепями и может получиться спиральная структура, идентичная исходной (нативной). На способности DNA к денатурации и ренатурации основан метод молекулярной гибридизации, который применяют для изучения строения нуклеиновых кислот. Препараты DNA, выделенные из особей, принадлежащих к разным видам, образуют несовершенные гибриды. Спиральная структура получается не по всей длине молекулы. В неспирализированных участках полинуклеотидные цепи не комплементарны друг другу. Следовательно, DNA особей неидентична.

Гибридизация DNA

Нуклеазы 

Нуклеиновые кислоты  гидролизуются под действием  нуклеаз -DNAазы и RNAазы. Гидролиз может  быть внеклеточным или внутриклеточным (специфическое функциональное расщепление).

Рестрикционные нуклеазы (рестриктазы)

Бактерии продуцируют набор  нуклеаз, которые разрезают нити DNA в определенных сайтах. Эти сайты  представляют собой определенную последовательность нуклеотидов, читаемую одинаково в обоих направлениях. Примеры последовательностей, узнаваемых E. coli, Bacillus amyloliquefaciens показаны на рисунке:

Примеры сайтов, узнаваемых рестрикционными  нуклеазами

Разные рестриктазы узнают разные последовательности. Рестриктазы бактерий участвуют в защите от чужеродной DNA, но, кроме того, они используются при изучении первичной структуры DNA. Молекула DNA животных и человека имеет огромные размеры: 130 млн. нуклеотидных пар имеют длину около четырех сантиметров. Такие молекулы неудобны для исследования. С помощью набора рестриктаз, узнающих разные последовательности, можно разрезать молекулу DNA на фрагменты желаемой длины, удобной для исследования.

Структурная организация  хроматина 

В состав хроматина входят DNA и гистоны - белки с высоким содержанием  лизина и аргинина. Предполагается, что аминогруппы радикалов этих аминокислот взаимодействуют с кислотными группами DNA. Цепи DNA обвивают глобулу гистонов, образуя четковидную структуру нуклеосом, которые связаны между собой линкерной цепочкой DNA. В дальнейшем эти нуклеосомы упаковываются в крупные хроматиновые структуры, благодаря чему достигается компактная их укладка в хромосомах.

Упаковка DNA и гистонов с образованием хроматина 

Поток информации от DNA к структуре белка

Нуклеиновые кислоты и белки  называют информационными молекулами, так как в чередовании их мономеров  заложен определенный смысл. Последовательность нуклеотидов в DNA определяет структуру  всех белков клетки. Участки DNA, кодирующие определенные белки (гены), копируются (транскрибируются) в виде полинуклеотидной цепи матричной RNA (mRNA), которая затем служит матрицей для синтеза белка. Таким образом, генетическая информация, записанная в DNA(в генотипе) обеспечивает образование фенотипических признаков клетки, то есть генотип трансформируется в фенотип. Это направление потока информации включает три типа матричных синтезов:

1. синтез DNA - репликация
2. синтез RNA - транскрипция
3. синтез белка - трансляция.

Репликация DNA

Репликация DNA (воспроизведение генотипа) происходит по полуконсервативному механизму. Каждая нить двойной спирали выступает в роли матрицы для синтеза новой цепи. Следовательно, вновь образованные двухспиральные молекулы состоят из одной «новой» и одной «старой» цепи.

Полуконсервативный  механизм репликации DNA

Субстратами синтеза являются дезоксинуклеозидтрифосфаты, выполняющие роль строительного материала и источников энергии. Для репликации DNA необходим большой набор разнообразных ферментов и белков - репликативный комплекс. Далее будет описана функция основных компонентов этого комплекса. Белки, раскручивающие спираль DNA, и белки, стабилизирующие разделенные нити DNA. В результате действия этих белков образуется репликативная вилка - участок DNA, в пределах которого спираль раскручена и разделена на отдельные цепи. DNA-полимераза обеспечивает включение в растущую «новую» цепь нуклеотидов комплементарных «старой», то есть матричной цепи. DNA-полимераза не способна начинать синтез новой цепи с ее первого нуклеотида. Она может удлинять уже имеющуюся цепь, поэтому для начала реакции требуется затравка (праймер), которая представляет собой короткий полинуклеотид, комплементарный матричной цепи DNA. Фермент присоединяется к матричной цепи DNA и к праймеру в области3’-концевого нуклеотида праймера. Перемещаясь по матрице в направлении ее 5’-конца, DNA-полимераза удлиняет затравку, присоединяя к ней один за другим нуклеотиды. Одноцепочечная затравка - праймер синтезируется при участии DNA- зависимой RNA-полимеразы (праймазы). Синтез новых цепей DNA может протекать только в направлении 5’ à 3’. Таким образом, на одной цепи DNA синтезируется непрерывно «лидирующая» цепь, а на другой образуются короткие фрагменты - «запаздывающая» цепь. Затем последовательность праймера удаляется и образовавшийся промежуток заполняется с помощьюDNA-полимеразы.

Репликация DNA

DNA-лигаза способна сшивать полученные короткие фрагменты, после чего формируется новая двухспиральная молекула DNA.

Репарация DNA

Поврежденные участки DNA или ошибочно встроенные нуклеотиды удаляются в результате действия специальных эндо - и экзонуклеаз.

Репарация DNA

Образующиеся промежутки заполняются  с помощью DNA-полимеразы и затем  сшиваются лигазами с исходной нитью DNA. Причинами, вызывающими повреждение DNA может быть действие факторов окружающей среды: ультрафиолетовое и ионизирующее излучение, определённые химические соединения.

Синтез RNA-транскрипция

Молекула DNA, хранящая генетическую информацию, непосредственного участия в  синтезе белка не принимает, но с  нее по мере необходимости считывается  информация, то есть специфические  участки DNA копируются (транскрибируются) в виде RNA с последующей трансляцией в полипептидную цепь белка. Транскрипция, как и репликация DNA, - эндоэргический процесс, сопряженный с использованием нуклеозидтрифосфатов в качестве субстратов и источников энергии.

Транскрипция DNA с образованием mRNA

RNA-полимераза катализирует синтез всех типов RNA. Особенностью действия этого фермента является то, что он предварительно «узнает» ту часть DNA, которую необходимо транскрибировать, и присоединяется к ней. Участок, с которым связывается RNA-полимераза, называется промотором. Последовательность оснований по ходу цепи DNA ниже сайта промотора с направлением 3’ à 5’ используется в качестве матрицы для синтеза RNA. Другая цепь остается нетранскрибируемой. RNA-полимераза вместе с растущей цепью RNA перемещается по матрице, пока не достигнет терминирующего кодона. В эукариотической DNA информация, необходимая для синтеза белка хранится на участках - экзонах, разделенных интронами - участками не содержащими генетической информации (некодирующие участки). При транскрипции гена сначала образуется первичный транскрипт, который затем подвергается «доработке» - процессингу. Суть доработки заключается в вырезании интронов (сплайсинг) из mRNA перед трансляцией и в присоединении характерных для mRNA концевых последовательностей.

Удаление интронов из mRNA

Синтез белка - трансляция генетической информации

Синтез белка сводится не к переписыванию  информации, а к переходу от одной  системы информации (нуклеотидная последовательность - четырехбуквенный язык) к другой (аминокислотная последовательность - двадцатибуквенный язык). Это объясняет, почему третий матричный синтез называют трансляцией. В основе передачи информации лежит биологический код - своеобразный словарь для перевода. Он имеет следующие особенности. Код специфический, потому что триплеты нуклеотидов (кодоны) mRNA кодируют каждый одну аминокислоту. Так как нуклеиновые кислоты состоят из комбинации четырех нуклеотидов, то существуют 64 различных триплета, кодирующих 20 аминокислот, поэтому код называется вырожденным. Например, аминокислота серин кодируется триплетами UCU, UCC, UCA, UCG, AGC. Часто при изменении третьего нуклеотида кодона аминокислота не изменяется, что объясняется его меньшей значимостью для трансляции по сравнению с первыми двумя основаниями. Генетический код непрерывный, неперекрывающийся и по существу универсальный - за редким исключением все организмы используют один и тот же код.

Биологический код (последовательность нуклеотидов  кодона считывается от центра к периферии)

Аминоацил-tRNA -cинтетаза и расшифровка  кода

Наиболее приспособлена к роли молекулы для расшифровки - tRNA, так как она может служить адаптером между триплетами нуклеотидов на mRNA и соответствующими им аминокислотами. Выполнение адаптерной функции становится возможным после связывания tRNA с определенной аминокислотой. Взаимное узнавание аминокислоты и tRNA происходит с помощью фермента - аминоацил-tRNA-синтетазы. Этот фермент узнает и связывает tRNA, а затем переносит аминокислотный остаток на 3’-ОН группу концевого аденозина, присоединяя ее сложно - эфирной связью: аа-tRNA-синтетазы + аминокислота + tRNA+ ATP à аминоацил-tRNA + АМР + Н₄Р₂О₇ Взаимодействие аа-tRNA с кодоном mRNA обеспечивается тем, что в одной из петель молекулы tRNA имеется триплет нуклеотидов - антикодон, комплементарный определенному кодону mRNA. Рибосомы - это частицы, на которых происходит синтез белка. Рибосомы прокариот имеют две субъединицы: малую - 30S субъединицу, состоящую из одной молекулы RNA и 21 белка, и большую - 50S субъединицу, состоящую из двух молекул RNA и 34 разных белков. Рибосомы эукариот имеют очень похожую структуру, но несколько более крупные - 40S и 60S-субъединицы. Малая субъединица связывается с mRNA, а tRNA соединяется с обеими субъединицами. По мере синтеза белка последовательность кодонов mRNA считывается один раз в процессе движения рибосомы вдоль матрицы. Как только сайт инициации mRNA освобождается одной рибосомой, с ним может связываться другая. Поэтому одна mRNA часто может быть связана с несколькими рибосомами, образуя полирибосому.

Инициация. До того как начнется синтез белка, формируется инициирующий комплекс, состоящий из малой и большой субъединиц рибосом, белковых факторов инициации и аминоацил - tRNA. Инициация запускается специфической последовательностью mRNA, содержащей кодон метионина. Элонгация. Большая субъединица рибосомы несет два рядом расположенных сайта связывания tRNA: один связывается с аминоацил -tRNA (сайт А), а другой - с пептидил - tRNA (сайт Р). Специфичность этих сайтов связывания определяется кодонами mRNA, комплементарными к антикодонам tRNA. Пептидильный остаток (или N-формилметионин на первой стадии) переносится на аминокислотный остаток tRNА, связанной с сайтом А, с образованием пептидил -tRNA в сайте А и «пустой» (свободной) tRNA в сайте Р. Это формирование пептидной связи катализируется рибосомальной пептидилтрансферазой.

Инициация трансляции у эукариот

«Свободная» tRNAпокидает Р-сайт и новая  пептидил -tRNA перемещается из А-сайта  в освободившийся Р-сайт, а рибосома продвигается по mRNA, чтобы поместить в свободный А-сайт новый кодон. Этот этап называется транслокацией. Этапы инициации, связывания аа-tRNA и транслокации протекают с использованием энергии GTР.