Афинная хроматография

 

 

 

Подвижная фаза аффинной хроматографии должна элюировать анализируемые соединения с оптимальными значениями k', обладать низкой вязкостью, обеспечивать необходимый уровень селективности, быть дешевой, нетоксичной, инертной, совместимой с методами детектирования (например, с УФ-детектором нельзя ис-пользовать в качестве элюента бензол). Обычно используют углеводороды (гексан, гептан, изооктан, циклогексан) с добавлением небольших количеств СНСl3, изо-С3Н7ОН, диизопропилового эфира. Если компоненты разделяемой смеси имеют близкие значения k', хроматографируют одним элюентом (изократический режим), если отдельные компоненты смеси сильно удерживаются сорбентом, используют серию элюентов возрастающей силы (ступенчатое или непрерывное градиентное элюирование).

Аффинная хроматография представляет собой один из наиболее специфических методов выделения реакционноспособных соединений, в частности, ферментов, и даже таких надмолекулярных агрегатов, как вирусы. Разделение биологически активных веществ в этом варианте хроматографии основано на их специфическом взаимодействии с лигандами, ковалентно связанными с нерастворимым носителем (матрицей). Сорбентом в этом случае служит гель типа агарозы, к которому ковалентно присоединен подходящий лиганд, например субстрат фермента. Когда раствор, содержа-щий выделяемое вещество (скажем, фермент), пропускают через колонку с соответствующим образом приготовленным сорбентом, взаимодействие этого вещества с закрепленным на сорбенте лигандом (в данном случае фермента с его субстратом) приводит к его удерживанию и, следовательно, к концентрированию. Поскольку сорбция носит обратный характер, это вещество можно затем элюировать с колонки. Разделение по методу аффинной хроматографии может быть основано на различного рода специфических взаимодействиях, таких как связывание фермента с ингиби-тором, гормона с рецептором, антигена с антителом, а также гибридизация полинуклеотидов. Этот метод позволяет выделять даже целые клетки.

 

 

 

 

 

 

 

Механизм разделения в аффинной хроматографии

Схематически механизм разделения в аффинной хроматографии

представлен на рис.12 [63]. Лиганд L фиксирован на матрице, целевое

вещество S связывается с лигандом и вследствие этого извлекается из раствора. На стадии элюирования комплекс разрушается и целевое вещество

вновь переходит в раствор.

Разделение основано на равновесной реакции:

L + S K,

где K – комплекс.

Взаимодействие вещество – лиганд должно быть специфическим и

обратимым. Характеристикой обратимости процесса является константа

диссоциации. Данные по константе диссоциации можно брать из литературных источников.

Лиганд должен иметь реакционноспособные функциональные группы, при помощи которых осуществляется его связь с матрицей, при этом

должна сохраняться биоспецифическая активность лиганда. Если лиганд

имеет несколько таких групп, его иммобилизация должна проводиться с

участием той из них, которая не входит в участок, взаимодействующий с

целевым веществом

 

 

 

Рис. 5. Механизм аффинной хроматографии:

Л - лиганд; Л — иммобилизованный лиганд; М — биологически активное вещество; МЛ - биоспецифический комплекс; ∆ - примеси; О - несорбирующиеся компоненты смеси

Активные центры многих биологически активных веществ (например, ферментов) часто локализованы в середине глобулы и недоступны для небольших молекул лигандов, непосредственно связанных с матрицей. По этому между матрицей и лигандом обычно встраивают дополнительный блок – «спейсер» (рис. 6).

Рис. 6. Иллюстрация роли «спейсера»: а – лиганд фиксирован непосредственно на матрице и недоступен для целевого вещества; б – лиганд фиксирован через промежуточный «спейсер» и способен взаимодействовать с молекулой целевого вещества

В качестве матрицы используются гели агарозы или полиакриламида. Выпускаются материалы с различными реакционноспособными группами, предназначенными для взаимодействия с лигандом. Схема реакции активации агарозы с помощью бромциана представлена на рис. 14а. На рис 14в приведена структурная формула активированной молекулы, готовой для связывания с лигандом. Выбор типа геля определяется типами функциональных групп лиганда.

 

Рис. 7. Активация молекулы агарозы и конденсация ее с лигандами: а – получение активированной молекулы агарозы; б – молекула агарозы, подготовленная для непосредственной конденсации с лигандом; в – конденсация активированной агарозы с лигандом или «спейсером», несущим амино- или карбоксигруппу

 

 

 

Аффинную хроматографию проводят в водных буферных растворах, подбирая оптимальные условия для каждого конкретного случая. Можно создать такие условия (значение рН раствора и концентрации соли), при которых взаимодействие целевого вещества с лигандом будет наиболее сильным. Среди других методов выделения веществ аффинная хроматография занимает особое место, поскольку процесс идет крайне специфически с использованием биологической активности целевого вещества. Эта особенность позволяет концентрировать целевые вещества из больших объемов растворов.

Аффинная хроматография применяется для выделения следующих классов веществ: аналогов субстратов, ингибиторов, кофакторов (при этом роль лигандов играют ферменты; антигенов, вирусов, клеток (лиганды –антитела); полисахаридов, гликопротеинов, клеток (лиганды – лектины); гистонов, полимераз (лиганды – нуклеиновые кислоты); рецепторов, бел-ков-переносчиков (гормоны, витамины); белков, специфически взаимодей-ствующих с мембраной клетки, лектинов (лиганды – клетки).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Разновидности аффинной хромотографии

Одной из разновидностью афинной хроматографии является металхелатная хроматография, основанная на образовании комплексов между нанесенным на сорбент ионом металла, например кадмия или никеля (никель-хелатная хроматография), и специфичеким линкером, обычно 6-10 остатков гистидина, химически связанным с целевым белком (Рис. 2). Особенно часто данный метод применяется при очистке генноинженерных белков, генетический код которых заклонирован в специально сконструированные плазмиды. В результате чего молекула белка экспрессируется с присоедененным полигистидиновым концом, за счет которого она специфичеки связывается ионом металла при нанесении на колонку, а примеси при этом не задерживаются, что позволяет достичь очень большой чистоты целевого продукта при минимальных затратах. Также, при необходимости возможно провести ренатурацию связанных с сорбентом белков (например обратным градиентом мочевины) после чего элюировать уже чистый биологически активный белок.

Рис. 7. Прикрепление белка с гистидиновой зацепкой к грануле в аффинной колонке. Около 10 гистидиновых остатков присоединены к белку с помощью генетической инженерии, например, сочетанием сайт-специфического мутагенеза с полимеразной цепной реакцией (ПЦР) (см. Nolting, 1999b).

Гистидиновые остатки прочно связываются с гранулами, сделанными из никель-хелатирующей смолы.

Также возможен несколько иной вариант аффинной хроматографии, в котором неправильно свернутый белок с помощью шаперонов сворачивается правильным образом и элюируется буферным раствором (Рис. 3).

 

 

Рис. 8. Исправление свертывания дорогих, плохо сворачивающихся, белков: шапероны, называемые также шаперонинами, прикреплены к гранулам, и развернутый или неправильно свернутый белок пропускается сквозь колонку. Шаперон взаимодействует с образцом белка и катализирует его сворачивание в правильной конформации.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Список литературы

1.Аффинная хроматография: Методы: Пер. с англ./ Под ред. П.Дина, У.Джонсона, Ф.Мидла. – М.: Мир, 1988 – 278с., ил.

2.А.Н. Ибрагимов, А.Г. Бикмуллин, Д.А. Сатаева, Л.В. Лопухов,

Л.И. Зайнуллин, Ф.К. Алимова

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОЧИСТКИ БЕЛКОВ

УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ

3.Остерман Л.А. Хроматография белков  и нуклеиновых кислот. – М.:, Наука, 1985. – 536 с.

4.Туркова Я. Аффинная хроматография: Пер. с англ. – М.: Мир, 1980. – 472 с.