Рентгеновские лучи

   Методу рентгеноструктурного анализа свойственны и серьёзные ограничения. Для проведения полного рентгеноструктурного анализа необходимо, чтобы вещество хорошо кристаллизовалось и давало достаточно устойчивые кристаллы. Иногда необходимо проводить исследование при высоких или низких температурах. Это сильно затрудняет проведение эксперимента. Полное исследование очень трудоёмко, длительно и сопряжено с большим объёмом вычислительной работы.

   Для установления атомной структуры средней сложности (~50- 100 атомов в элементарной ячейке) необходимо измерять интенсивности нескольких сотен и даже тысяч дифракционных отражений. Эту весьма трудоёмкую и кропотливую работу выполняют автоматические микроденситомеры и дифрактометры, управляемые ЭВМ, иногда в течение нескольких недель и даже месяцев (например, при анализе структур белков, когда число отражений возрастает до сотен тысяч). В связи с этим в последние годы для решения задач рентгеноструктурного анализа получили широкое применение быстродействующие ЭВМ. Однако даже с применением ЭВМ определение структуры остаётся сложной и трудоёмкой работой. Применение в дифрактометре нескольких счётчиков, которые могут параллельно регистрировать отражения, время эксперимента удаётся сократить. Дифрактометрические измерения превосходят фоторегистрацию по чувствительности и точности.

   Позволяя  объективно определить структуру молекул  и общий характер взаимодействия молекул в кристалле, исследование методом рентгеноструктурного анализа  не всегда даёт возможность с нужной степенью достоверности судить о различиях в характере химических связей внутри молекулы, так как точность определения длин связей и валентных углов часто оказывается недостаточной для этой цели. Серьёзным ограничением метода является  также трудность определения положений лёгких атомов и особенно атомов водорода. 
 

      Использование 
 

Сегодня единственным экспериментальным способом с достаточной (атомарной) точностью узнать, что представляет собой трехмерная структура белка, является рентгеноструктурный, или кристаллографический, анализ. Именно с его помощью добывается исходный материал для красивых картинок, которыми обильно украшены статьи и обложки научных журналов. И, разумеется, не только для картинок: без преувеличения можно сказать, что экспериментальные белковые структуры представляют собой основу современной вычислительной молекулярной биологии.

Рентгеноструктурный анализ имеет почти столетнюю  историю, но применяться на самых  сложноорганизованных биологических  объектах начал лишь в 1960-х годах - начиная с революционных экспериментов Перутца по расшифровке структуры миоглобина и гемоглобина. На сегодняшний день известны структуры около 15 тыс. белков и их комплексов с биологически важными молекулами.

Основные принципы рентгеноструктурного анализа довольно просты и знакомы каждому со школьных уроков физики. Кристаллический объект представляет собой серию практически идентичных объектов, упакованных в трехмерную решетку. Монохроматическое рентгеновское излучение (с длиной волны от 0,7 до 1,6 Е, соизмеримой с межатомными расстояниями в молекулах), проходя через кристалл, рассеивается на электронных оболочках периодически повторяющихся атомов и образует дифракционную картину (рис. 1). С помощью Фурье-преобразования полученной дифракции электронную плотность исследуемого кристалла можно рассчитать по формуле:

Единственная трудность  принципиального характера - это  невозможность на данном этапе развития техники получить когерентное монохроматическое  рентгеновское излучение высокой  интенсивности, что, в свою очередь, приводит к невозможности экспериментального определения фазового сдвига дифракционной картины. Впрочем, узнать эту неизменяемую величину можно обходным путем. Таких путей немало, и все они требуют высокого мастерства исследователя, а порой и везения. Не вдаваясь в подробности методов определения фаз, можно сказать, что обычно на решение такой задачи тратится до полугода. После грубого определения фаз можно рассчитать приблизительную форму электронной структуры исследуемой молекулы. Заключительный этап рентгеноструктурного определения структуры - это интерпретация электронной плотности, или рентгеноструктурное уточнение. На данном этапе структура многократно подвергается программной подгонке и ручной доводке для достижения наилучшего совпадения с электронной плотностью.

С математической точки  зрения, идет минимизация некой штрафной функции в пространстве координат  молекулы. Огромная размерность системы  не позволяет найти искомый минимум  автоматически и требует постоянного  визуального контроля. Такова сухая теория.

На практике все  выглядит гораздо красивее и заманчивее. В данном обзоре, который наверняка  является самым кратким в мире, нет места рассказывать о методике наращивания  и выделения белков из бактерий и методике его очистки. Получение из раствора белка кристаллов до сих пор не объяснено научно и больше похоже на шаманство. Тем не менее, этим способом все пользуются, хотя и имеют о нем смутное представление. А созерцание кристаллов белка, особенно в поляризованном свете, доставляет массу наслаждения (рис. 2).

С каждым годом совершенствуется техника сбора данных и улучшается техническое оснащение рентгеноструктурного экспериментатора. Все больше синхротронов, как источников мощного рентгеновского излучения, переоборудуются для нужд кристаллографии. Давно вошла в практику криозащита (с помощью жидкого азота) кристаллов во время облучения. Детекторы дифрагированного излучения постоянно улучшаются, растет чувствительность, размер площади одновременного детектирования и скорость записи полученных данных.

К сожалению, за последнее  время методика уточнения не претерпела существенных изменений. Большинство  современнейших программных комплексов мало отличаются от программ десятилетней давности. Как и десять, и двадцать лет назад, идет ручной фиттинг (подгонка) белковой модели к электронной плотности (рис. 3). Теоретическое же осмысление огромного экспериментального материала вообще находится в плачевном состоянии. Структурная биология в этом отношении является уникальной наукой. Теория организации белковых структур практически не продвинулась от первых работ Рамачандрана, отставая почти на полвека от экспериментальных исследований.

Огромное поле деятельности открывается для молодых исследователей на стыке физики, химии и биологии. Эта область науки испытывает острую потребность как в физиках и химиках, так и в программистах, интересующихся основами жизнедеятельности земных организмов.

К сожалению, экспериментальная  база в России сильно уступает оснащению  зарубежных институтов. Тем временем в Америке и Европе открываются сотни, а то и тысячи новых мест для кристаллографов. Коммерческие фирмы, разрабатывающие лекарственные препараты, испытывают нехватку высококвалифицированных кадров (какая-то реклама капиталистического труда получается). 
 
 
 
 
 

      СПИСОК  ЛИТЕРАТУРЫ. 

1. Жданов  Г.С. Физика твёрдого тела, М., 1962.
2. Блохин М.А., Физика рентгеновских лучей, 2 изд., М., 1957.
3. Блохин М.А., Методы рентгеноспектральных исследований, М., 1959.
4. Ванштейн Э.Е., Рентгеновские спектры атомов в молекулах химических соединений и в сплавах, М.-Л., 1950.
5. Бокай Г.Б., Порай-Кошиц М.А., Рентгеноструктурный анализ, М., 1964.
6. Шишаков Н.А., Основные понятия структурного анализа, М., 1961.