Фотометрия

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный машиностроительный университет (МАМИ)»

 

 

 

Факультет химико-технологического оборудования

Кафедра «Биотехнология»

 

 

 

 

 

 

КУРСОВАЯ РАБОТА

по дисциплине «Общая биофизика»

на тему:  «Фотометрия»

 

 

 

 

Научный руководитель темы:                                                          Мальцевская Н. В.  Исполнитель темы:                                студентка группы 141-622    Шмойлова А. А.

 

 

МОСКВА 2016

СОДЕРЖАНИЕ

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  1. Введение

 Фотометрия (от греч. photós - свет и греч. metréo - измеряю) – это раздел общей физики, занимающийся измерением света. Фотометрия широко применяется как вид молекулярно-абсорбционного анализа, основанного на пропорциональной зависимости между концентрацией однородных систем (например, растворов) и их светопоглощением в видимой, ИК и УФ областях спектра.

 Фотометрические и спектрометрические методы анализа применяются для определения многих (более 50) элементов Периодической системы, главным образом металлов, анализируются руды, минералы, объекты окружающей среды, продукты переработки обогатительных и гидрометаллургических предприятий. Эффективно эти методы используется в металлургической, электронной областях промышленности, в медицине, биологии, криминалистике и т.д. Большое значение они имеют в аналитическом контроле окружающей среды и решении экологических проблем. Значительно расширились области практического применения методов абсорбционной спектроскопии благодаря более широкому использованию инфракрасной области спектра и приборов на базе ЭВМ. Это позволило разработать методы анализа сложных многокомпонентных систем без их химического разделения. Простые, быстрые и точные методы анализа имеют огромное значение для исследования различных реакций, установления состава и исследования различных химических соединений. Успехи химии координационных соединений, достижения микроэлектроники, приборостроения дают все основания ожидать дальнейшего повышения точности и чувствительности этих методов.

 В производственных  условиях при анализе сплавов, концентратов, руд, солей, удобрений, шлаков  требуется определять элементы  при их высоком содержании. Обычно  такие определения выполняют  продолжительными гравиметрическими  и титриметрическими методами, часто  требующими отделения определяемого  компонента от большинства сопутствующих  элементов. Более быстрые фотометрические  методы неприменимы из-за высоких  оптических плотностей (выше 0,8). Для  уменьшения оптической плотности  раствор разбавляют, что вызывает  при больших разбавлениях ошибки, связанные с изменениями объемов. Более разбавленный раствор можно  приготовить также уменьшением  навески; точность в таком случае  обуславливается только погрешностью  взвешивания.

 Основными метрологическими  характеристиками фотометрии являются: чувствительность, воспроизводимость, правильность, предел обнаружения и точность.

 Чувствительность метода  определяется углом наклона графика  в координатах: абсорбционность – концентрация. Тангенс угла наклона равен молярному коэффициенту абсорбции. Чем больше значение молярного коэффициента, тем чувствительнее определение концентрации данным методом. Значение чувствительности 1*10-6– 1*10-7.

 Воспроизводимость метода обуславливается двумя типами случайных погрешностей: аналитическими (методическими и химическими) и инструментальными. Для повышения воспроизводимости метода желательно измерять абсорбционность в максимуме поглощения. Значение воспроизводимости 2-5%.

 Правильность фотометрического  метода характеризуется близостью, полученных практически, истинному  содержанию определяемого компонента. Значение правильности 99%.

 Предел обнаружения  рассчитывают, исходя из значения  молярного коэффициента абсорбции  и толщины поглощающего слоя. Значение предела обнаружения 10-8 – 10-10%.

 Точность фотометрических  методов зависит от индивидуальных  областей используемых химических  реакций, характеристик применяемого  прибора и других факторов, изменяется  довольно в широких пределах. Значение точности 1-2%.

 Погрешности могут  возникать в связи с отклонением  от основного закона фотометрии. Значения погрешности 0,2-0,5%. [1]

   2. Теоретическая часть

  2.1. Фотометрические методы анализа

Методы анализа, основанные на поглощении электромагнитного излучения анализируемыми веществами, составляют обширную группу абсорбционных оптических методов. При поглощении света атомы и молекулы анализируемых веществ переходят в новое возбужденное состояние. В зависимости от вида поглощающих частиц и способа трансформирования поглощенной энергии различают:

 1. Атомно-абсорбционный анализ, основанный на поглощении световой энергии атомами анализируемых веществ.

 2. Молекулярный абсорбционный анализ, т.е. анализ поглощения света молекулами анализируемого вещества в ультрафиолетовой, видимой и инфракрасной областях спектра (спетрофотометрия, фотоколориметрия, ИК-спектроскопия).

 3. Анализ поглощения и рассеяния световой энергии взвешенными частицами анализируемого вещества (турбидиметрия, нефелометрия).

 4. Люминесцентный (флуорометрический) анализ, основанный на измерении излучения, возникающего в результате выделения энергии возбужденными молекулами анализируемого вещества.

 Все эти методы иногда объединяют в одну группу спектрохимических или спектроскопических методов анализа, хотя они и имеют существенные различия. Фотоколориметрия и спектрофотометрия основаны на взаимодействии излучения с однородными системами, и их обычно объединяют в одну группу фотометрических методов анализа.

 В фотометрических методах используют избирательное поглощение света молекулами анализируемого вещества. Согласно квантовой механике свет представляет собой поток частиц, называемых квантами или фотонами. Энергия каждого кванта определяется длиной волны излучения. В результате поглощения излучения молекула поглощающего вещества переходит из основного состояния с минимальной энергией E1 в более высокое энергетическое состояние Е2. Электронные пере- ходы, вызванные поглощением строго определенных квантов световой энергии, характеризуются наличием строго определенных полос поглощения в электронных спектрах поглощающих молекул. Причем поглощение света происходит только в том случае, когда энергия поглощаемого кванта совпадает с разностью энергий ∆Е между квантовыми энергетическими уровнями в конечном (E2) и начальном (E1) состояниях поглощающей молекулы:

 hv = ∆Е = Е2 – E1

 Здесь h – постоянная Планка (h = 6,625×10–34 Дж•с); v – частота поглощаемого излучения, которая определяется энергией поглощенного кванта и выражается отношением скорости распространения излучения с (скорости световой волны в вакууме с = 3×1010 см/с) к длине волны λ; v = с/λ. Частота излучения v измеряется в обратных секундах (с –1), герцах (Гц). 1 Гц = 1 с –1.

 Длина волны λ измеряется в ангстремах (1 Å = 1×10–8 см), микрометрах или микронах (1 мкм = 1 мк = 1×10–6 м), нанометрах или миллимикронах (1 нм = 1 ммк = 10 Å = 1×10–9 м).    

Энергия излучения характеризуется электромагнитным спектром, охватывающим область от километровых радиоволн до десятых долей ангстрема γ- излучения и космических лучей. Для характеристики участка спектра часто используют также волновое число θ, которое показывает, какое число длин волн приходится на 1см пути излучения в вакууме, и определяется соотношением: θ = 1/λ.

 Природа полос поглощения в ультрафиолетовой (10–400нм) и видимой (400– 760нм) областях спектра одинакова и связана главным образом с числом и расположением электронов в поглощающих молекулах и ионах. В инфракрасной области (0,8–1000 мкм) она в большей степени связана с колебаниями атомов в молекулах поглощающего вещества.

 В зависимости от используемой аппаратуры в фотометрическом анализе различают спектрофотометрический метод – анализ по поглощению монохроматического света и фотоколориметрический – анализ по поглощению полихроматического (немонохроматического) света в видимой области спектра. Оба метода основаны на пропорциональной зависимости между светопоглощением и концентрацией поглощающего вещества.

 Фотометрические методы подразделяют на прямые и косвенные. В прямых методах определяемый ион М с помощью реагента R переводят в светопоглощающее соединение MR, а затем измеряют интенсивность светопоглощения раствора этого соединения. При косвенных определениях используют вспомогательные со- единения, которые при взаимодействии с определяемым веществом либо разрушаются сами, либо образуют новые светопоглощающие соединения. [2]

    2.2. Основные закономерности светопоглощения

При прохождении через слой вещества (раствора) светового потока с интенсивностью I0 его интенсивность в результате поглощения в слое, отражения и рас- сеяния уменьшается до значения I. Интенсивности падающего светового потока I0 и светового потока I, прошедшего через раствор, можно определить экспериментально. При относительных измерениях поглощения света истинными растворами потерями излучения вследствие отражения и рассеяния обычно пренебрегают.

 Связь между интенсивностями световых потоков I0 и I устанавливается законом Бугера-Ламберта, согласно которому однородные слои одного и того же вещества одинаковой толщины поглощают одну и ту же долю падающей на них свето- вой энергии (при постоянной концентрации растворенного вещества).

 Математически этот закон выражается уравнением экспоненциальной зависимости:

 I = I0e al (1), где е – основание натуральных логарифмов; а – коэффициент поглощения; l – толщина поглощающего слоя.

 Отношение: T = I/I0 называют пропусканием; его значения могут изменяться от 0 до 1. Часто эту величину выражают в процентах. Если величина Т отнесена к толщине слоя в 1 см, то ее называют коэффициентом пропускания. Поглощение излучения характеризуют оптической плотностью: A = lg(I0/I) = –lgT.

 Связь между концентрацией поглощающего раствора и его оптической плотностью lg(I0/I) выражается законом Бера, согласно которому оптическая плотность раствора прямо пропорциональна концентрации растворенного вещества при постоянной толщине слоя: Lg(I0/I) = k1C (2),

 где k1 – коэффициент пропорциональности;   С – концентрация растворенного вещества. Зависимость интенсивности монохроматического светового потока, прошедшего через слой окрашенного раствора, от интенсивности падающего потока света, концентрации окрашенного вещества и толщины слоя раствора определяется объединенным законом Бугера-Ламберта-Бера, который является основным законом светопоглощения и лежит в основе большинства фотометрических методов анализа: I = I0×10–kCl (3) где k – коэффициент светопоглощения, зависящий от природы растворенного вещества, температуры, растворителя и длины волны света.

 Если концентрация С выражена в молях на литр, а l – в сантиметрах, то k представляет собой молярный коэффициент светопоглощения при длине λ и обозначается ελ. В таком случае уравнение примет вид: Cl I I λ −ε = 0 ×10 (4).

 При соблюдении основного закона светопоглощения оптическая плотность раствора прямо пропорциональна молярному коэффициенту светопоглощения, концентрации поглощающего вещества и толщине слоя раствора: А = ελСl (5).

 При графическом изображении зависимости оптической плотности от концентрации (при постоянном значении l) получается прямая линия. Эта прямая проходит через начало координат при отсутствии поглощения света растворителем и систематических погрешностей.

 Уравнения 4 и 5 выведены для монохроматического света, т.е. света определенной длины волны, который может быть выделен при помощи специального оптического устройства – монохроматора. В фотоколориметре измерение интенсивности световых потоков производят не в монохроматическом, а в полихроматическом свете, т.е. на довольно широком участке спектра – в интервале длин волн 20–100 нм. В этом случае в уравнении 5 вместо молярного коэффициента светового поглощения ελ. можно использовать значение среднего молярного коэффициента светопоглощения (εср), зависящие от ширины полосы пропускания светофильтра (εcp < ελ). [3]

    2.3. Спектры поглощения

Спектр поглощения, или, более корректно, абсолютный спектр поглощения вещества представляет собой зависимость количества поглощенного света от длины волны. Такие спектры для красителей в видимой области (400–700 нм) имеют иногда несколько максимумов. Спектры поглощения в ультрафиолетовой (200–400 нм) и видимых областях отражают переходы связанных и несвязанных электронов в молекуле. Это обычно делокализованные π-электроны двойных С=С связей и неподеленные пары азота и кислорода. Поскольку, как правило, все электроны в молекуле при комнатной температуре находятся на нижнем энергетическом уровне, спектры в этой области дают информацию об основном и первом возбужденном электронных состояниях молекулы. Ввиду того, что длина волны поглощенного света соответствует определенному переходу, пики на спектрах поглощения вещества обусловлены присутствием в нем известных структур. Длина волны, при которой 4 наблюдается максимальное поглощение света, обозначается через λмакс. Положение максимума спектра поглощения является важной оптической характеристикой вещества, а характер и вид спектра поглощения характеризуют его качественную индивидуальность. Группа в молекуле, которая дает вклад в спектр ее поглощения, называется хромофором. Такой группой является, например, карбонильная группа >С=О, существующая у всех аминокислот. Другим хромофором является пептидная группа полипептидных цепей. К основным хромофорам белка относятся остатки ароматических кислот: триптофан и в меньшей степени тирозин и фенилаланин. Спектр поглощения триптофана, обусловленный его индольным кольцом с системой сопряженных связей, обладает двумя полосами поглощения с максимумами при 220 и 280 нм. В нуклеиновых кислотах основными хромофорами являются пуриновые и пиримидиновые азотистые основания нуклеотидов. При образовании сопряженных связей в молекуле энергия возбужденного состояния электронов уменьшается, и, следовательно, хромофор начинает поглощать свет большей длины волны. Такой сдвиг в спектрах поглощения называется батохромным. Наоборот, сдвиг спектра в коротковолновую область именуется гипсохромным. Гиперхромный и гипохромный эффекты – это соответственно увеличение и уменьшение экстинкции. Обнаружить очень близко расположенные линии колебательных и вращательных переходов на спектрах молекул удается лишь при высоком разрешении (разрешением называется способность прибора различать две близко расположенные линии). [4]