Методы генной инженерии

Инсулин состоит  из двух полипептидных цепей А  и В длиной 20 и 30 аминокислот. При  соединении их дисульфидными связями образуется нативный двухцепочечный инсулин.  

Было показано, что он не содержит белков E. coli, эндотоксинов и других примесей, не дает побочных эффектов, как инсулин животных, а по биологической активности от него не отличается.  

Соматотропин - гормон роста человека, секретируемый гипофизом. Недостаток этого гормона приводит к гипофизарной карликовости. Если вводить соматотропин в дозах 10 мг на 1 кг веса три раза в неделю, то за год ребенок, страдающий от его недостатка, может подрасти на 6 см.  

Ранее его получали из трупного материала, из одного трупа: 4 - 6 мг соматотропина в пересчете  на конечный фармацевтический препарат. Таким образом, доступные количества гормона были ограничены, кроме того, гормон, получаемый этим способом, был  неоднороден и мог содержать медленно развивающиеся вирусы.  

Компания "Genentec" в 1980 году разработала технологию производства соматотропина с помощью бактерий, который был лишен перечисленных  недостатков. В 1982 году гормон роста  человека был получен в культуре E. coli и животных клеток в институте Пастера во Франции, а с 1984 года начато промышленное производство инсулина и в СССР.  

Цели и методы генетической инженерии 
 

Цель прикладной генетической инженерии заключается  в конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека.  

На технологии рекомбинантных ДНК основано получение  высокоспецифичных ДНК-зондов, с  помощью которых изучают экспрессию генов в тканях, локализацию генов в хромосомах, выявляют гены, обладающие родственными функциями (например, у человека и курицы). ДНК-зонды также используются в диагностике различных заболеваний. 

Технология рекомбинантных ДНК сделала возможным нетрадиционный подход «белок-ген», получивший название «обратная генетика». При таком подходе из клетки выделяют белок, клонируют ген этого белка, модифицируют его, создавая мутантный ген, кодирующий измененную форму белка. Полученный ген вводят в клетку. Таким способом можно исправлять дефектные гены и лечить наследственные заболевания. 

Если гибридную  ДНК ввести в оплодотворенное  яйцеклетку, могут быть получены трансгенные  организмы, передающие мутантный ген  потомками.  

Генетическая  трансформация животных позволяет  установить роль отдельных генов и их белковых продуктов как в регуляции активности других генов, так и при различных патологических процессах.  

Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы: 

·              специфическое расщепление ДНК  рестрицирующими нуклеазами, ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами; 

·              быстрое секвенирование всех нуклеотидов  очищенном фрагменте ДНК, что  позволяет определить границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую им; 

·              конструирование рекомбинантной ДНК; 

·              гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая  выявлять специфические последовательности РНК или ДНК с большей точностью  и чувствительностью; 

·              клонирование ДНК: амплификация in vitro с  помощью цепной полимеразной реакции или введение фрагмента ДНК в бактериальную клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий; 

·              введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы.  
 

Ферменты генетической инженерии 
 

Генетическая  инженерия - потомок молекулярной генетики, но своим рождением обязана успехам  генетической энзимологии и химии  нуклеиновых кислот, так как инструментами  молекулярного манипулирования  являются ферменты.  

Если с клетками и клеточными органеллами мы подчас можем работать микроманипуляторами, то никакие, даже самые мелкие микрохирургические инструменты не помогут при работе с макромолекулами ДНК и РНК. 

Только ферменты могут найти определенные последовательности нуклеотидов, «разрезать» там молекулу или, наоборот, «заштопать» дырку в цепи ДНК.  

Эти ферменты издавна  находятся в клетке, выполняя работы по репликации (удвоению) ДНК при  делении клетки, репарации повреждений (восстановлению целостности молекулы), в процессах считывания и переноса генетической информации из клетки в клетку или в пределах клетки.  

Задача генного  инженера - подобрать фермент, который  выполнил бы поставленные задачи, то есть смог бы работать с определенным участком нуклеиновой кислоты.  

Следует отметить, что ферменты, применяемые в генной инженерии, лишены видовой специфичности, поэтому экспериментатор может сочетать в единое целое фрагменты ДНК любого происхождения в избранной им последовательности.  

Это позволяет  генной инженерии преодолевать установленные  природой видовые барьеры и осуществлять межвидовое скрещивание.  

Ферменты, применяемые  при конструировании рекомбинантных ДНК, можно разделить на несколько  групп:  

·                   ферменты, с помощью которых получают фрагменты ДНК (рестриктазы);  

·                   ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК (полимеразы) или РНК (обратные транскриптазы); 

·                   ферменты, соединяющие фрагменты  ДНК (лигазы);  

·                   ферменты, позволяющие осуществить  изменение структуры концов фрагментов ДНК. 
 

Достижения генетической инженерии 
 

С помощью генетической инженерии созданы линии животных, устойчивых к вирусным заболеваниям, а также породы животных с полезными  для человека признаками.  

Например, микроинъекция  рекомбинантной ДНК, содержавшей ген соматотропина быка в зиготу кролика позволила получить трансгенное животное с гиперпродукцией этого гормона. Полученные животные обладали ярко выраженной акромегалией. 

Генная инженерия  открыла путь для производства продуктов  белковой природы путем введения в клетки микроорганизмов, искусственно синтезированных генов, где они могут экспрессироваться (встраиваться) в состав гибридных молекул.  

Первой удачной  попыткой такого рода стала работа К. Итакуры и Г. Бойера с соавторами (1977г.) по экспрессии в Е. coil химически синтезированного гена, кодирующего гормон млекопитающих - соматостатин.  

Ген соматостатина  был получен на основе сведений о  первичном строении этого пептидного гормона, состоящего всего из 14 аминокислот. Использованный в этой работе подход оказался весьма перспективным для получения и многих других пептидных гормонов.  

В различных  лабораториях в СССР и за рубежом  были созданы штаммы Е. coli, синтезирующие  в составе гибридных белков гормон роста человека (соматотропин), пептидные  гормоны — брадикинин и ангиотензин, нейропептид лей-энкефалин и др.  

Ген гормона  роста человека длиной 584 п.н.— наиболее длинный из искусственно синтезированных  в настоящее время. Он был встроен  в плазмиду, реплицирующуюся в  Е. coli под контролем промотора  триптофанового оперона.  

Трансформированные  полученной химерной плазмидой клетки Е. coli продуцировали при индукции промотора около 3 млн. молекул гормона  роста человека в расчете на клетку. Этот полипептид, как было установлено  в экспериментах на крысах с удаленным гипофизом, по функциям оказался полностью идентичен гормону роста человека. 

В 1976г. Гилберт  и Максам в Гарвардском университете, а также Сэнгер разработали быстрый  метод химического анализа ДНК. Появилась реальная возможность  определять последовательность до 1000 нуклеотидов в неделю силами одного исследователя.  

В 1982-1985гг. стало  возможно создать прибор для автоматического  анализа нуклеиновых кислот (а  значит и генов).  

Еще один важнейший  этап - это синтез биополимеров по установленной  структуре. Первые коммерческие приборы, производящие автоматизированный синтез полипептидов, были разработаны на основе исследований Меррифилда в 1963г. Они используются в исследовательских лабораториях и в фармацевтической промышленности. 

Метод химического  синтеза генов обеспечил также возможность получения штаммов бактерий продуцентов инсулина человека, важного лечебного препарата для больных диабетом.  

«Ген инсулина синтезировали в виде более сорока в основном шестичленных олигонуклеотидов, которые затем объединяли в единую структуру с помощью ДНК-лигазы. Полученные двухцепочечные полинуклеотиды длиной 271 и 286 пар оснований были встроены в плазмидные векторы. Туда же были встроены и регуляторные участки ДНК, обеспечивающие экспрессию гибридных молекул. Клонированные гены кодировали синтез проинсулина, который путем несложной химической обработки можно превратить в активный инсулин, включающий две полипептидные цепи А и В из 21 и 30 аминокислотных остатков, соединенных между собой сульфгидрильными связями». 

Таким способом получены и клонированы гены, кодирующие глобины человека, животных и птиц, белок хрусталика глаза быка, яичный белок, фиброин шелка, продуцируемый  тутовым шелкопрядом, и др.  

Этот же принцип  был применен для получения, клонирования и экспрессии генов интерферона человека в бактериях. Интерферон - ценный лекарственный препарат, широко используемый для борьбы с вирусными инфекциями и лечения ряда других заболеваний, включая злокачественные опухоли. Интерферон вырабатывается в клетках животных и человека, но обладает выраженной видовой специфичностью.  

Ю. А. Овчинников и В. Г. Дебабов с сотрудниками получили микроорганизмы, эффективно синтезирующие интерфероны человека. Этим исследователям удалось сконструировать  рекомбинантные плазмиды, обуславливающие синтез интерферона человека в Е. coli.  

Очищенный из клеток бактерий интерферон по своим физико-химическим и биологическим свойствам оказался близок интерферону, находящемуся в  крови доноров.  

За счет введения в векторную плазмиду сигнальных последовательностей, инициирующих синтез и РНК и белка, удалось получить бактерии, способные синтезировать до 5 мг интерферона в расчете на 1л суспензии бактерий. Это в 5000 раз больше, чем содержится в 1л крови доноров. Замена Е. coli на микробы некоторых других видов позволяет еще больше увеличить производительность такой «фабрики интерферона». 

К открытиям  связанным с достижениями генной инженерии нужно прибавить то, что огромный генетический «чертеж» многоклеточного существа просчитан  полностью.  

После восьми лет работы многих исследовательских групп удалось точно определить 97 миллионов пар нуклеотидов и их местонахождение в спирали ДНК, хранящей полную наследственную информацию микроскопического червячка Сaenorhabditis elegans длиной около миллиметра.  

Хотя это очень  маленький червь, скорее червячок, с  него без всякого преувеличения  начинается новая эра в биологии. Геном этой нематоды состоит из 97 миллионов пар нуклеотидов ДНК, округленно 0,1 миллиарда пар. Геном  человека, согласно большинству оценок, - 3 миллиарда нуклеотидных пар. Разница в 30 раз. Однако именно эта работа, о которой идет речь, окончательно убедила даже самых закоренелых скептиков, что расшифровка строения всего генома человека не только возможна, но и достижима в ближайшие годы. 

Естественно, расшифровать геном таких гигантских размеров, как у названной нематоды (97 миллионов пар нуклеотидов ДНК), невозможно без огромной подготовительной работы. Ее в основном завершили к 1989 году. Прежде всего, была построена физическая карта всего генома нематоды. Физическая карта представляет собой небольшие участки ДНК известной структуры (маркеры), расположенные на определенных расстояниях один от другого.  

И вот с 1990 года началось само секвенирование. Его  темп составлял в 1992 году 1 миллион  пар нуклеотидов в год. Если бы такой темп сохранился, на расшифровку всего генома понадобилось бы почти 100 лет! Ускорить работы удалось простейшим способом - число исследователей в каждом центре возросло примерно до 100. По мере того, как раскрывалась нуклеотидная последовательность ДНК C. elegans, пришлось расстаться с двумя заблуждениями: