Возможности генной инженерии

Этапы получения генной продукции

           Процедура получения и использования синтетической генной продукции, состоит из нескольких этапов.

• Внедрение интересующего исследователей гена (выделенного, модифицированного либо синтезированного) в векторную молекулу ДНК in vitro с помощью рекомбинации. В роли вектора может выступать плазмидная ДНК, либо нуклеиновая кислота вируса или фага. Например, ген ИФН человека вводят в геном бактериофага X.

• Введение рекомбинантной (гибридной) векторной ДНК в клетку. В рассматриваемом примере этот этап заключается в заражении клеток кишечной палочки гибридными фагами.

• Отбор клеток, экспрессирующих введённый ген (молекулярное клонирование)

• Культивирование отобранных клонов.

• Трансформация бактериальных клеток в результате включения экзогенной ДНК приводит к появлению нового генетического маркёра. Для эукариот аналогичный процесс — трансфекция эукариотических клеток (в связи с тем, что термин «трансформация» обозначает переход в состояние неконтролируемого роста и применяется по отношению к опухолевому перерождению клеток).  

• Избирательная инактивация гена («адресное» разрушение гена, антисмысловая блокировка гена или производимой им РНК), позволяющая вывести из строя любой ген внутри клетки. Этот процесс известен также как «нокаутирование» [от англ. to knock out, сбивать с ног], а модифицированные организмы — как нокаутные. Направленное изменение гена (адресный мутагенез in vivo, генная инженерия in vitro — ex vivo) пo желанию исследователя.  

• Невозможность культивировать микроорганизм-продуцент. В частности, возбудители сифилиса, проказы, малярии не растут на искусственных средах. Поэтому для получения вакцинных или диагностических препаратов, гены, кодирующие синтез необходимых Аг, выделяют и встраивают в геном легко культивируемых микроорганизмов (например, кишечной палочки).  

• Высокая опасность заражения при работе с патогенными микроорганизмами. В таких случаях идентифицируют основные Аг возбудителя и встраивают кодирующие их гены в геномы безопасных микроорганизмов. В частности, выращиванием рекомбинантных штаммов кишечной палочки и дрожжей получены основные Аг ВИЧ (например, р24, gp41, gpl20).  

• Высокая стоимость продуктов, получаемых традиционными методами. В частности, методом генной инженерии получают многие цитокины (а-ИФН, ИЛ, миелопептиды) и гормоны (инсулин, соматотропный гормон).  

           Особое значение имеет создание методами генной инженерии диагностических, лечебных и профилактических препаратов, ранее получаемых дорогостоящими методами. Чаще всего это продукты, выделяемые из крови иммунизированных доноров, — животных и людей. Технология получения гибридом основана на выделении от доноров клеток-продуцентов и их слияния с миеломными (опухолевыми) клетками. В результате образуется гибридная клетка — гибридома, способная быстро и бесконечно размножаться и подобным способом часто получают AT. Предшественники гибридом — плазматические клетки, синтезирующие Ig определённого типа. Поэтому получаемые продукты получили название моноклональных AT. Наиболее часто применяют линии миеломных клеток мышей и крыс. Частота слияний в смешанной культуре клеток (миеломных и донорских клеток-продуцентов) невелика — одна гибридома на 104 клеток.

            Образовавшиеся гибридомы немедленно реклонируют, так как многие гибридные клетки склонны «выбрасывать» лишние хромосомы, пока их число не будет равным диплоидному набору (при этом гены, ответственные за антителообразование, могут быть утрачены). Гибридомы создают не только на основе В-клеток, но и Т-лимфоцитов и многих других, секретирующих лимфокины, факторы роста и т.д. Продукты, полученные технологией гибридом, применяют для лечения и профилактики различных болезней, а также для изучения строения и функций различных молекул (например, клеточных рецепторов). В частности, при помощи гибридом получают моноклональные AT, применяемые в иммуногистохимической диагностике опухолей.  
 

Клонирование  животных

 
       Овечка Долли, клонированная из клеток вымени другой, мертвой особи, заполонила газеты в 1997 г. Исследователи Университета Рослин (США) раззвонили об успехах, не акцентируя внимание публики на сотнях неудач, которые были до этого. Долли не была первым клоном животного, но была самой знаменитой. В действительности, в мире клонированием животных занимаются уже все последнее десятилетие. В Рослине держали успех в секрете, пока им не удалось запатентовать не только Долли, но и весь процесс ее создания. ВИПО (Всемирная организация по охране интеллектуальной собственности) выдала Университету Рослин эксклюзивные патентные права на клонирование всех животных, не исключая людей, до 2017 года. Успех Долли вдохновил ученых по всему земному шару барахтаться в создательстве и играть в господа Бога, несмотря на негативные последствия для животных и окружающей среды.  
      В Таиланде ученые пытаются клонировать знаменитого белого слона короля Рамы -III, умершего 100 лет назад. Из 50 тыс. диких слонов, живших в 60-х, в Таиланде осталось только 2000. Тайцы хотят возродить стадо. Но вместе с тем не понимают, что если современные антропогенные нарушения и уничтожение местообитаний не прекратится, та же судьба ожидает клоны. Клонирование, как и вся генная инженерия в целом - это жалкая попытка решить проблемы, игнорируя их коренные причины.  
      Музеи, вдохновленные фильмами про парк Юрского периода, успехами технологии клонирования в реальном мире, обследуют свои коллекции в поисках образцов ДНК вымерших животных. Существует план попробовать клонировать мамонта, чьи ткани хорошо сохранились в арктических льдах. Вскоре после Долли, Рослин породил Полли - клонированного ягненка, несущего ген человеческого белка в каждой клетке тела. Это рассматривалось как шаг к массовой продукции человеческих белков в животных для лечения таких человеческих болезней как тромбоз. Как и в случае с Долли, особо не афишировался тот факт, что успеху предшествовало множество неудач - в рождении очень крупных детенышей, вдвое больше нормального размера - до 9 кг при норме 4,75 кг. Это не может являться нормой даже в случаях, когда наука о клонировании развивается быстрыми темпами. В 1998 г. исследователи США и Франции сумели клонировать телят голштинской породы из клеток плода. Если раньше процесс создания клона требовал 3 года, то теперь он занимает всего 9 месяцев. С другой стороны, каждый девятый клон был неудачным и умирал или уничтожался.  
      Клонирование - это серьезный риск для здоровья. Исследователи столкнулись со множеством случаев гибели плода, послеродовых смертей, плацентарных абнормальностей, абнормальных отечностей, втрое и вчетверо большую частоту проблем с пуповиной и серьезную иммунологическую недостаточность. У крупных млекопитающих, таких как овцы и коровы, исследователи находят, что примерно половина клонов содержит серьезные нарушения, включая специфические дефекты сердца, легких и других органов, ведущие к перинатальной смертности. Аккумулированные генетические ошибки инфицируют и влияют на поколения клонов. Но ведь невозможно отдать в починку дефектный клон как сломанную машину. 

Клонирование  и биоразнообразие  

   Уже сейчас ежегодно уменьшающееся биоразнообразие подвергается еще большей угрозе из-за клонирования животных. Восприимчивость скота к болезням также серьезно увеличивается благодаря монокультурам. Генетическое разнообразие лежит в основе высокой жизнеспособности естественных популяций, включая их гибкую реакцию на изменение условий. Это свойство будет полностью уничтожено в популяции клонов. В 70-х годах в США погиб почти весь урожай кукурузы. Это произошло в результате повсеместного использования монокультуры клонированных семян с ограниченным генотипом. То же самое может случиться с клонированным скотом.  

Ксенотрансплантация

 
    Компании и отдельные лица исторически "владели" коровами и стадами животных. Но никогда - видом в целом, и никогда прежде им не было дано право запрещать выращивание этих животных другими. То, свидетелями чего мы являемся - это конверсия животных организмов в корпоративную собственность. Несмотря на то, что в США с конца XVIII в. живые организмы исключены из патентования, сотни таких организмов и их частей были запатентованы. Приведем список некоторых наиболее активных компаний, работающих в области ксенотрансплантации. Это American Home Products (США), PPL (США/Великобритания), Novo Nordisk (Дания), Boehringer Indelheim (Германия), Genzyme Transgenics и Advanced Cell Technology (США), Novartis (Швейцария), а также уже упоминавшийся британский институт Рослин.  
    Novartis (через Ciba Geigy and Sandoz) ведет исследования по трансплантации последние 20 лет. Совсем недавно открылось новое направление в области ксенотрансплантации с приобретением Британской биотехнологической компании Imutran. Она разводит свиней для использования в человеческой трансплантации. Несколько лет назад компания оказалась в центре скандала, отправив самолетом свиней в голландский центр изучения приматов для вызвавших противоречивую реакцию экспериментов по трансплантации свиных тканей обезьянам. Imutran было предъявлено обвинение в том, что нарушал строгие правила экспериментов с ГМ - животными, посылая свиней за пределы страны. За 2 года до этого Королевское общество защиты животных обвинило голландский центр по исследованию приматов в содержании обезьян в неприемлемых условиях, и нашло, что их благополучие находится под большой угрозой.  
     Несмотря на риск, к концу 1997 года 20 человек получили трансплантаты свиной печени. (А всего трансплантаты свиной ткани получили 150 пациентов во всем мире). Многие диабетики были посажены на свиную печень и почки в машинах временного диализа. В июне 1998 года плодовые мушки были изменены человеческими генами, которые усиливали способности их клеток выводить шлаки и удлиняли их жизнь на 40%. Но очевидно, что исследователи видят в этом начало пути к замедлению человеческого старения. Проект компании PPL (США) включает создание стада коров, вырабатывающих человеческие белки, и кроликов с человеческим кальцитонином, который помогает замещать кость. Компания Pharmino (Нидерланды) производит в коровах человеческий лактоферин, который активизирует иммунную систему. Корпорации Genzyme Transgenics и Advanced Cell Technology сотрудничают, чтобы создать стада скота, который будет носителем человеческих протеинов в крови и мясе, например, таких как альбуминовая сыворотка, используемая, чтобы поддерживать жидкостной баланс крови у жертв ожогов.  
    Одна из главных проблем в межвидовой трансплантации - фактор отторжения. Но было открыто, что в организме свиней за это отвечает одна молекула сахара, и исследователи пытаются удалить ее методами генной инженерии. С другой стороны, ученые генетически модифицируют свиней с человеческими протеинами, которые служат как идентификационный сигнал для человеческой иммунной системы. Это принимается системой защиты человеческого тела, таким образом, орган не отторгается.  
    Независимо от выгод и риска Совет Европы проголосовал за мораторий на клиническое тестирование трансплантатов из органов животных на людях в январе 1999 г.  
    Патогены (например, свиные) могут прижиться в людях. Несколько животных вирусов очень похожи на человеческие: вирус коровьего бешенства в форме CG, коровья лейкемия, псевдобешенство свиней и коровий вирус иммунодефицита, похожий на СПИД. Последний не существовал ранее, а теперь заражает 10-20% коров. Животные могут быть использованы как запасные части для людей. Каковы последствия наличия свиных клеток в вашем теле? Новые виды-рабы могут появиться для специальных целей поставки органов или медицинских препаратов для людей.  
    Клонирование животных для использования их как фабрик гормонов для людей развивается усиленными темпами. Эта технология интересует ученых и компании из-за количества органов, гормонов и фармацевтических препаратов, которые могут быть произведены. То, что началось как использование обезьяньих и свиных органов для создания человеческих трансплантатов, теперь стало настоящим театром абсурда.  
    Королевский женский госпиталь в Мельбурне (Австралия) создает мышь, которая производит человеческую сперму, трансплантируя ей клетки человеческих яичек. В Японии университет Тоттори достиг тех же результатов, и теперь они хотят попробовать оплодотворить человеческую яйцеклетку спермой, произведенной мышью. Грудное молоко производится в коровах и козах. Техасский университет A&M получил 2,3 миллиона долларов на клонирование сдохшей собаки - любимицы одной пары.  

Создание трансгенных растений

 
 
              Еще 10 лет тому назад биотехнология растений заметно отставала в своем развитии, но за последние 3 года наблюдается быстрый выброс на рынок трансгенных растений с новыми полезными признаками. Трансгенные растения в США в 1996 году занимали площадь 3 млн. акров, в 1997 году площадь увеличилась до 15 млн. акров, в 1998 году – до 60 млн. акров, а в прошлом году до 80 млн. акров. Поскольку основные трансгенные формы кукурузы, сои, хлопчатника с устойчивостью к гербицидам и насекомым хорошо себя зарекомендовали, есть все основания ожидать, что площадь под генноиженерные растения в будущем (2001 году) увеличатся в 4-5 раз.  
В апреле 1998 года доля в процентах трансгенных форм растений в  
сельском хозяйстве составило:  
- кукуруза – 6  
- соя – 12  
- хлопчатник – 15  
- томаты – <1  
 
          Так как число жителей за последнее столетие увеличилось с 1.5 до 5.5  
млрд. человек, а к 2020 году предполагается вырост до 8 млрд., таким  
образом возникает огромная проблема, стоящая перед человечеством. Эта  
проблема заключается в огромном увеличение производства продуктов питания, несмотря на то, что за последние 40 лет производство увеличилось в 2.5 раза, все равно этого не достаточно. И в мире в связи с этим наблюдается  
социальный застой, который становится все более настоятельным. Другая  
проблема возникла с медицинским лечением. Несмотря на огромные достижения современной медицины, производимые сегодня лекарственные препараты столь дороги, что часть населения земли сейчас полностью полагаются на традиционные донаучные методы лечения, прежде всего на неочищенные препараты растительного происхождения. В развитых странах лекарственные средства на 25% состоят из природных веществ, выделенных из растений. Открытия последних лет (противоопухолевые препараты: таксол, подофиллотоксин) свидетельствуют о том, что растения еще долго будут оставаться источником полезных биологически-активных веществ  
(БТА), и что способности растительной клетки к синтезу сложных БТА все еще значительно превосходят синтетические способности инженера-химика. Вот почему ученые взялись за проблему создания трансгенных растений. Отсчёт истории генетической инженерии растений принято вести с 1982  
года, когда впервые были получены генетически трансформированные растения. Метод трансформации основывается на природной способности бактерий Agrobacterium tumefaciens генетически модифицировать растения.  
Реконструированные штаммы Agrobactrium, содержащие неонкогенные варианты Ti- плазмид и обладающие повышенной вирулентностью, стали основой одного из наболее популярных методов трансформации. Первоначально трансформация применялась для генно-инженерных двудольных растений, однако работы последних лет свидетельствуют, что этот метод эффективен и в отношении кукурузы, риса, пшеницы. Другим широко распространённым методом трансформации, является технология, основанная на обстреле ткани микрочастицами золота (или других тяжелых металлов), покрытыми раствором ДНК. Все выращиваемые ныне коммерческие сорта получены с помощью названных выше двух методов.  
Современный арсенал методов трансформации, однако, довольно обширен и  
включает такие подходы, как введение ДНК в голые клетки (протопласты),  
электропорация клеток, микроинъекций ДНК в клетки, прокалывание клеток  
путём встряхивания их в суспензии микроигл, опосредованная вирусами  
инфекции и так далее. Генетические изменённые растения с устойчивостью к различным классам гербицидов в настоящее время являются наиболее успешным биотехнологическим продуктом. Дело в том, что биотехнология позволила совершить такой прыжок, так как оказалось возможным генетически изменять устойчивость растений к тем или иным гербицидам либо путем введения генов, кодирующих белки, нечувствительные к данному классу гербицидов, либо за счет введениягенов, обеспечивающих ускоренный метаболизм гербицидов растений. К настоящему времени клонированы гены, кодирующие нечувствительные к действию гербицидов  
ферменты-мишени, что дало возможность получать трансгенные растения,  
устойчивые к таким гербицидам, как глифостат и хлорсульфуроновым, и  
имидазолиноновым гербицидом. Изолированы также гены, которые кодируют ферменты деградации некоторых гербицидов, что позволило получить трансгенные растения устойчивые к фосфинотрицину и далапону. В 1997 году устойчивая к Roundup соя, распространяемая компанией "As Grow", была признана в США сельскохозяйственным продуктом года. Ученые пошли далее. Так как множество растений подвержены нападению и  
поеданию со стороны насекомых, то ученые генной инженерии провели  
эксперимент с давно известной бактерией Bacillus-Thiringiensis, которая  
продуцирует белок, оказалось, что она является очень токсичной для многих видов насекомых, но в то же время безопасна для млекопитающих, белок (дельта - эндотаксин, CRY-белок) продуцируется различными штамами Bacillus- Thiringiensis. Это прототаксин, который расщепляется в кишечнике насекомых, образуя активированный токсин. Активизированный белок специфично связывается с рецепторами средней кишки насекомых, что приводит к образованию пор и лизису клеток кишечного эпителия. Взаимодействие токсинов с рецепторами строго специфично, что усложняет подбор комбинации токсин - насекомое. В природе найдено большое количество штаммов Bacillus- Thiringiensis, чьи токсины действуют только на определенные виды насекомых. Препараты Bacillus-Thiringiensis в течение десятилетий использовались для контроля насекомых на полях. Встраивание гена этого белка в геном растений дает возможность получить трансгенные растения, не поедаемые насекомыми. Но этот метод потребовал большой работы со стороны генной инженерии, в плане подборов необходимых  
штаммов и созданию генно-инженерных конструкций, которые дают наибольший эффект для конкретных классов насекомых. Кроме видоспецифичности по действию на насекомых встраивание прокариотических генов дельта-токсинов в геном растений даже под контролем сильных эукариотических промоторов не привело к высокому уровню экспрессии. Предположительно такое явление возникло в связи с тем, что эти бактериальные гены содержат значительно больше адениновых и тиминовых нуклеатидных оснований, чем растительная ДНК. Эта проблема была решена путем создания модефицированных генов, где один  
из природного гена вырезали и добавили те или иные фрагменты с сохранением доменов, кодирующих активные части дельта-токсинов. Так, например, с помощью таких подходов был получен картофель, устойчивый к колорадскому жуку. В настоящее время так называемый Bt – растения хлопка и кукурузы занимают основную долю в общем объеме генетически модифицированных растений этих культур, которые выращивают на полях США. 

Генные  вакцины 
 

           Вакцины — одно из самых значительных достижений медицины, их  
использование к тому же чрезвычайно эффективно с экономической точки  
зрения. В последние годы разработке вакцин стали уделять особое внимание.  
Это обусловлено тем, что до настоящего времени не удалось получить  
высокоэффективные вакцины для предупреждения распространенных или  
опасных инфекционных заболеваний. По данным созданной в прошлом году  
международной организации Всемирный союз по вакцинам ииммунизации» (в числе ее участников — ВОЗ, ЮНИСЕФ, Международная федерация ассоциаций производителей фармацевтической продукции, Программа Билла и Мелинды Гейтс по вакцинации детей, Рокфеллеровский фонд и др.), в настоящее время отсутствуют эффективные вакцины, способные предупредить развитие СПИДа, туберкулеза и малярии, от которых в 1998 г. умерло около 5 млн человек. Кроме того, увеличилась заболеваемость, обусловленная теми инфекциями, с которыми человечество ранее успешно боролось. Этому способствовало появление лекарственно-устойчивых форм микроорганизмов, увеличение числа ВИЧ-инфицированных пациентов с иммунной недостаточностью, ослабление систем здравоохранения в странах с переходной экономикой, увеличение миграции населения, региональные конфликты и др. При этом распространение микроорганизмов, устойчивых к воздействию антибактериальных препаратов, приобрело характер экологической катастрофы и поставило под угрозу эффективность лечения многих тяжелых заболеваний. Повышенный интерес к вакцинам возник после того, как была установлена роль патогенных микроорганизмов в развитии тех заболеваний, которые ранее не считали инфекционными. Например, гастриты, пептическая язва желудка и двенадцатиперстной кишки, ассоциированная с H. pylori, злокачественные новообразования печени (вирусы гепатита В и С). Поэтому в последние 10–15 лет правительства многих стран стали принимать меры, направленные на интенсивную разработку и производство принципиально новых вакцин. Например, в США в 1986 г. был принят закон («National Vaccine Injury Compensation Act»), защищающий производителей вакцин от юридической ответственности при подаче судебных исков, связанных с развитием побочных реакций при вакцинации, если они не были обусловлены  
ошибками при производстве вакцины. С изменением ситуации увеличился и  
мировой рынок вакцин, объем продаж которого в 1998 г. составил 4 млрд  
долларов США в стоимостном выражении. Однако многие считают, что в  
ближайшие годы этот сектор фармацевтической промышленности будет  
развиваться гораздо быстрее. Так, согласно публикациям в американском  
журнале «Signals Magazine» (январь 1999 г.), который освещает ситуацию в  
современной биотехнологической промышленности, объем продаж вакцин на мировом рынке через 10 лет составит 20 млрд долларов США. Этот прогноз принадлежит М. Греко, исполнительному директору компании «MerieuxMSD», совместного предприятия крупнейших производителей вакцин — компаний «Pasteur Merieux Connaught» (теперь «Aventis Pasteur») и «Merck & Co.».