Векторы, использующиеся в генной инженерии

     На  рис. 1 показан один из самых распространенных плазмидных векторов E.coli - pBR322. Он сконструирован на базе детально изученной плазмиды E.coli - колициногенного фактора ColE1 - и содержит ориджин репликации этой плазмиды. Особенность плазмиды ColE1 (и pBR322 соответственно) состоит в том, что в присутствии ингибитора синтеза белка антибиотика хлорамфеникола (опосредованно ингибирующего репликацию хозяйской хромосомы) ее число в E.coli возрастает от 20-50 до 1000 молекул на клетку, что позволяет получать большие количества клонируемого гена. При конструировании вектора pBR322 из исходных плазмид был делегирован целый ряд "лишних" сайтов для рестриктаз.  

Рисунок 1. Детальная рестрикционная карта плазмиды pBR322.

     В настоящее время наряду с множеством удобных векторных систем для  E.coli сконструированы плазмидные векторы для ряда других грамотрицательных бактерий (в том числе таких промышленно важных, как Pseudomonas, Rhizobium и Azotobacter), грамположительных бактерий (Bacillus), низших грибов (дрожжи) и растений.

Плазмидные векторы удобны для клонирования относительно небольших фрагментов (до 10 тыс. пар оснований) геномов небольших размеров. Если же требуется получить клонотеку (или библиотеку) генов высших растений и животных, общая длина генома которых достигает огромных размеров, то обычные плазмидные векторы для этих целей непригодны. Проблему создания библиотек генов для высших эукариот удалось решить с использованием в качестве клонирующих векторов производных бактериофага l.

     Среди фаговых векторов наиболее удобные системы были созданы на базе геномов бактериофагов l и М13 E.coli. ДНК этих фагов содержит протяженные области, которые можно делегировать или заменить на чужеродную ДНК, не затрагивая их способности реплицироваться в клетках E.coli. При конструировании семейства векторов на базе ДНК l фага из нее сначала (путем делений коротких участков ДНК) были удалены многие сайты рестрикции из области, не существенной для репликации ДНК, и оставлены такие сайты в области, предназначенной для встраивания чужеродной ДНК. В эту же область часто встраивают маркерные гены, позволяющие отличить рекомбинантную ДНК от исходного вектора. Такие векторы широко используются для получения "библиотек генов". Размеры замещаемого фрагмента фаговой ДНК и соответственно встраиваемого участка чужеродной ДНК ограничены 15-17 тыс. нуклеотидных остатков, так как рекомбинантный фагоый геном, который на 10% больше или на 75% меньше генома дикого l фага, уже не может быть упакован в фаговые частицы. [6]

     Таких ограничений теоретически не существует для векторов, сконструированных  на базе нитчатого бактериофага М13. Описаны случаи, когда в геном  этого фага была встроена чужеродная ДНК длиной около 40 тыс. нуклеотидных остатков. Известно, однако, что фаг  М13 становится нестабильным, когда  длина чужеродной ДНК превышает 5 тыс. нуклеотидных остатков. Фактически же векторы, полученные из ДНК фага М13, используются главным образом для секвенирования и мутагенеза генов, и размеры встраиваемых в них фрагментов намного меньше.

     Эти векторы конструируются из реплекативной (двутяжевой) формы ДНК фага М13, в которую встроены "полилинкерные" участки (пример такой конструкции показан на рис. 2). В фаговую частицу ДНК включается в виде однотяжевой молекулы. Таким образом, этот вектор позволяет получать клонированный ген или его фрагмент как в двутяжевой, так и в однотяжевой форме. Однотяжевые формы рекомбинантных ДНК широко используются в настоящее время при определении нуклеотидной последовательности ДНК методом Сэнгера и для олигодезоксинуклеотид-направленного мутагенеза генов.

Перенос чужеродных генов в клетки животных осуществляется с помощью векторов, полученных из ДНК ряда хорошо изученных  вирусов животных - SV40, некоторых  аденовирусов, вируса папиломы быка, вируса оспы и так далее. Конструирование этих векторов проводится по стандартной схеме: удаление "лишних" сайтов для рестриктаз, введение маркерных генов в области ДНК, не существенные для ее репликации (например, гена тимидин-киназы (tk) из HSV (вируса герпеса)), введение регуляторных районов, повышающих уровень экспрессии генов.

     Удобными  оказались так называемые "челночные  векторы", способные реплицироваться как в клетках животных, так и в клетках бактерий. Их получают, сшивая друг с другом большие сегменты векторов животных и бактерий (например, SV40 и pBR322) так, чтобы районы, ответственные за репликацию ДНК, остались незатронутыми. Это позволяет проводить основные операции по конструированию вектора в бактериальной клетке (что технически намного проще), а затем полученную рекомбинантную ДНК использовать для клонирования генов в животной клетке. [7] 

     Рисунок 2. Рестрикционная карта вектора М13 mp8.

4. Создание  достаточно удобных и по возможности  универсальных векторов для целевой  доставки генов в клетки ткани  и организма  
 

     Важным  моментом при конструировании ДНК-вакцин является проблема целенаправленной доставки генов в необходимые клетки и  защиты вводимых ДНК от действия нуклеаз  крови. В результате экспериментальной  работы были созданы разнообразные  конструкции, позволяющие доставлять целевые гены в клетки-мишени.

     Одной из подобных конструкций является модель молекулярного вектора для доставки генов в такие клетки, как лимфоциты  и кераноциты. В качестве модельного был использован ген, кодирующий гибридный белок: фактор некроза опухолей-альфа - интерферон-гамма. В центре вектора находится интактная плазмидная ДНК, содержащая доставляемый ген, а на поверхности располагаются антитела к клеткам-мишеням. Конъюгат полиглюкина со спермидином и антителами применяется для связи компонентов (положительно заряженный спермидин обеспечивает связывание конъюгата с плазмидной ДНК). Описанный молекулярный вектор позволяет целенаправленно доставлять гены в клетки-мишени, сводя до минимума их попадание в другие виды клеток, защищать доставляемые гены от нуклеаз крови и использовать положительно заряженный комплекс спермидин-полиглюкин в качестве стимулятора проникновения ДНК в клетки.

     В настоящее время также создана  векторная модель для доставки в  клетки костного мозга гена, кодирующего  гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека (чГ-КСФ). Данный белок относится к семейству гемопоэтических факторов роста и является одним из физиологических регуляторов, специфически и высокоэффективно стимулирующих пролиферацию и дифференцировку гемопоэтических предшественников нейтрофилов. чГ-КСФ увеличивает продолжительность жизни клеток костного мозга, усиливает функциональную активность зрелых нейтрофилов. Созданный вектор представляет собой многослойную конструкцию. "Центральным ядром" конструкции является плазмида pGGF8, содержащая ген чГ-КСФ. Ее окружает полисахаридная оболочка, которая состоит из полиглюкина и спермидина. Внешний белковый слой содержит смесь сывороточного альбумина и белка доставки - трансферина. Эффективность описанной векторной модели была доказана опытным путем.

     Итак, при конструировании рекомбинантных противовирусных вакцин немаловажное значение имеет создание специального вектора-носителя, обеспечивающего адресную доставку генов и их защиту от действия нуклеаз крови. [8] 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

СПИСОК  ЛИТЕРАТУРЫ 

1. Грен  Э. Я., Пумпен П. П. Рекомбинантные вирусные капсиды - новое поколение иммуногенных белков и вакцин // Журнал ВХО. - 1988. - т. II, №5. - с. 531-536.

2. Дмитриев  Б. А. Проблемы и перспективы  создания синтетических вакцин // Иммунология. - 1986. - №1. - с. 24-29.

3. Лебедев  Л. Р., Сизов А. А., Масычева В. И., Карпенко Л. И., Рязанкин И. А. Молекулярный вектор для доставки генов в клетки-мишени // Биотехнология. - 2001. - №1. - с. 3-12.

4. Мертвецов  Н. П., Беклемишев А. Б., Савич  И. М. Современные подходы к  конструированию молекулярных вакцин. - Новосибирск: Наука, 1987, 210 с.

5. Сизов А. А., Лебедев Л. Р., Масычева В. И., Кашперова Т. А., Одегов А. М. Разработка вирус-подобной конструкции для рецептор-опосредованного транспорта гена чГ-КСФ в клетки костного мозга in vivo // Биотехнология. - 2001. - №1. - с. 13-18.

6. Шабарова З. А., Богданов А. А., Золотухин А. С. Химические основы генетической инженерии. - М.: Изд-во МГУ, 1994, 224 с.

7. Щелкунов  С. Н. Клонирование генов. - Новосибирск:  Наука, 1986, 232 с.

8. Юров  Г. К., Народицкий Б. С., Юров К. П. Конструирование и использование ДНК-вакцин // Ветеринария. - 1998. - №12. - с. 25-27.