Технология получения инсулина

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН

КАЗАХСКИЙ АГРОТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ С.СЕЙФУЛЛИНА

Кафедра микробиологии и биотехнологии

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

КУРСОВАЯ РАБОТА

По дисциплине «Биотехнологии мокроорганизмов»

 

 

На тему: Технология получения инсулина

 

 

 

Выполнила: Мырзабек Мөлдір Курбанбекқызы_________

 

 

 

Проверила: Акимбаева А.К (к. б. н.)__________________

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Астана – 2013

СОДЕРЖАНИЕ

 

Определения………………………………………………………………….. Сокращения и обозначения………………………………………………….	3 4
Введение………………………………………………………………………	5
Основная часть……………………………………………………….. История открытия…………………………………………………. Получение инсулина в биотехнологии………………………….. Способы получения инсулина человека……………………………. Экспрессия проинсулина в клетках Е.coli. ……………………… Очистка инсулина…………………………………………………. Способ применения и дозы………………………………………. ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………………… СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………..	6 6 6 7 9 10 13 14 15

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

В данной курсовой работе применялись следующие определения:

Белок носитель - обеспечивающий транспортировку гибридного белка в периплазматическое пространство клетки или культуральную среду;  
Аффинный компонент - существенно облегчающий выделение гибридного белка. 

Инсулин (от лат. insula - остров) - гормон пептидной природы, образуется в бета-клетках островков Лангерганса поджелудочной железы.

Интерлейкины - группа цитокинов, синтезируемая в основном лейкоцитами (по этой причине было выбрано окончание «-лейкин»).

Проинсулин - это предшественник инсулина, синтезирующийся В-клетками островкового аппарата поджелудочной железы.

Хроматография (от греч. chroma, chromatos - цвет, краска), физико-химический метод разделения и анализа смесей, основанный на распределении их компонентов между двумя фазами - неподвижной и подвижной (элюент), протекающей через неподвижную.

Инкапсуляция - механизм языка программирования, ограничивающий доступ к составляющим объект компонентам (методам и свойствам), делает их приватными, то есть доступными только внутри объекта. 

Гибридный белок (англ. fusionprotein, также химерный, составной белок) - белок, полученный объединением двух или более генов, изначально кодировавших отдельные белки.

Гормоны (от греч. hormáo - привожу в движение, побуждаю), инкреты, биологически активные вещества, вырабатываемые эндокринными железами, или железами внутренней секреции, и выделяемые ими непосредственно в кровь.

Сахарный диабет-группа эндокринных заболеваний, развивающихся вследствие абсолютной или относительной недостаточности гормона инсулина.

Инкапсуляция - механизм языка программирования, ограничивающий доступ к составляющим объект компонентам (методам и свойствам), делает их приватными, то есть доступными только внутри объекта.

Соматостатин - гормон дельта-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы, а также один из гормонов гипоталамуса. 

Радиоиммунный анализ - метод количественного определения биологически активных веществ, (гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и др.) в биологических жидкостях, основанный на конкурентном связывании искомых стабильных и аналогичных им меченных радионуклидом веществ со специфическими связывающими системами.

 

 

СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ

 

% - процентное  содержание

гг - годы

ОФ - обращеннофазовой

ВЭЖХ - высокоэффективной жидкостной хроматографией

ИО - ионообменной

кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота

MP -монопиковые

MC - монокомпонентные

ФИТЦ - фенилизотиоцианатом

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ВВЕДЕНИЕ

Основная функция инсулина - обеспечивать проницаемость клеточных мембран для молекул глюкозы. В упрощенном виде можно сказать, что не только углеводы, но и любые питательные вещества, в конечном счете, расщепляются до глюкозы, которая и используется для синтеза других содержащих углерод молекул, и является единственным видом топлива для клеточных энергостанций – митохондрий. Без инсулина проницаемость клеточной мембраны для глюкозы падает в 20 раз, и клетки умирают от голода, а растворенный в крови избыток сахара отравляет организм.

Нарушение секреции инсулина вследствие деструкции бета-клеток - абсолютная недостаточность инсулина - является ключевым звеном патогенеза сахарного диабета 1-го типа. Нарушение действия инсулина на ткани - относительная инсулиновая недостаточность - имеет важное место в развитии сахарного диабета 2-го типа.

Использование аффиннойхромотографии значительно снизило содержание в препарате загрязняющих белков с более высокой м.м., чем у инсулина. К таким белкам относятся проинсулин и частично расщепленные проинсулины, которые способны индуцировать выработку антиинсулиновых антител.

Использование человеческого инсулина с самого начала терапии сводит к минимуму возникновение аллергических реакций. Человеческий инсулин быстрее абсорбируется и независимо от формы препарата имеет более короткую длительность действия, чем животные инсулины. Человеческие инсулины менее иммуногены, чем свиные, особенно смешанные бычьи и свиные инсулины.

Целью данной курсовой работы является изучить технологию получения инсулина. Для достижения были поставлены следующие задачи:

1.получение инсулина в биотехнологии

2. способы получения инсулина 

З. очистка инсулина

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

1. История открытия

История открытия инсулина связана с именем русского врача И.М. Соболева (вторая половина 19 века), доказавшего, что уровень сахара в крови человека регулируется специальным гормоном поджелудочной железы.

В 1922 году инсулин, выделенный из поджелудочной железы животного, был впервые введен десятилетнему мальчику, больному диабетом результат превзошел все ожидания, и уже через год американская фирма «Eli Lilly» выпустила первый препарат животного инсулина.

После получения первой промышленной партии инсулина в последующие несколько лет пройден огромный путь его выделения и очистки. В результате гормон стал доступен для больных сахарным диабетом 1 типа.

В 1935 году датский исследователь Хагедорн оптимизировал действие инсулина в организме, предложив пролонгированный препарат.

Первые кристаллы инсулина были получены в 1952 году, а в в1954 году английский биохимик Г. Сенджер расшифровал структуру инсулина. Развитие методов очистки гормона от других гормональных веществ и продуктов деградации инсулина позволили получить гомогенный инсулин, называемый однокомпонентным.

В начале 70-х гг. советскими учеными А. Юдаевым и С. Швачкиным был предложен химический синтез инсулина, однако осуществление данного синтеза в промышленном масштабе было дорогостоящим и нерентабельным.

В дальнейшем шло прогрессирующее улучшение степени очистки инсулинов, что уменьшало проблемы, обусловленные инсулиновой аллергией, нарушениями работы почек, расстройством зрения и иммунной резистентностью к инсулину. Был необходим наиболее эффективный гормон для заместительной терапии при сахарном диабете – гомологичный инсулин, то есть инсулин человека.

В 80-годах достижения молекулярной биологии позволили синтезировать с помощью E.coli обе цепи человеческого инсулина, которые были, затем соединены в молекулу биологически активного гормона, а в Институте биоорганической химии РАН получен рекомбинантный инсулин с использованием генно-инженерных штаммов E.coli.

1.2 Получение инсулина в биотехнологии

Инсулин, пептидный гормон островков Лангерганса поджелудочной железы, представляет основное средство лечения при сахарном диабете. Эта болезнь вызвана дефицитом инсулина и проявляется повышением уровня глюкозы в крови. До недавнего времени инсулин получали из поджелудочной железы быка и свиньи. Препарат отличался от человеческого инсулина 1-3 аминокислотными заменами, так что возникала угроза аллергических реакций, особенно у детей. Широкомасштабное терапевтическое применение инсулина сдерживалось его высокой стоимостью и ограниченностью ресурсов. Путем химической модификации инсулин из животных удалось сделать неотличимым от человеческого, но это означало дополнительное удорожание продукта.[1] 
Компания Eli Lilly с 1982 г. производит генно-инженерный инсулин на основе раздельного синтеза Е. colieА - и В-цепей. Стоимость продукта значительно снизилась, получаемый инсулин идентичен человеческому. С 1980 г. в печати имеются сообщения о клонировании гена проинсулина - предшественника гормона, переходящего в зрелую форму при ограниченном протеолизе. 
К лечению диабета приложена также технология инкапсулирования: клетки поджелудочной железы в капсуле, введенные однократно в организм больного, продуцируют инсулин в течение года. 
Компания Integrated Genetics приступила к выпуску фолли-кулостимулирующего и лютенизирующего гормонов. Эти пептиды составлены из двух субъединиц. На повестке дня вопрос о промышленном синтезе олигопептидных гормонов нервной системы -энкефалинов, построенных из 5 аминокислотных остатков, и эндорфинов, аналогов морфина. При рациональном применении эти пептиды снимают болевые ощущения, создают хорошее настроение, повышают работоспособность, концентрируют внимание, улучшают память, приводят в порядок режим сна и бодрствования. Примером успешного применения методов генетической инженерии может служить синтез р-эндорфина по технологии гибридных белков, описанной выше для другого пептидного гормона, соматостатина[2].

 

1.3 Способы получения инсулина человека

Исторически первым способом получения инсулина для терапевтических целей является выделение аналогов этого гормона из природных источников (островков поджелудочной железы крупного рогатого скота и свиней). В 20-х годах прошлого века было установлено, что бычий и свиной инсулины (которые являются наиболее близкими к инсулину человека по своему строению и аминокислотной последовательности) проявляют в организме человека активность, сравнимую с инсулином человека. После этого долгое время для лечения пациентов, страдающих сахарным диабетом I типа, применяли инсулины быка или свиньи. Однако через некоторое время было показано, что в ряде случаев в организме человека начинают накапливаться антитела к бычьему и свиному инсулинам,

тем самым сводя на нет их действие.  
С другой стороны, одним из преимуществ этого метода получения инсулина является доступность исходного сырья (бычий и свиной инсулин можно легко получать в больших количествах), что и сыграло решающую роль при разработке первого способа получения инсулина человека. Этот метод получил название полусинтетического[3]. 
При этом способе получения инсулина человека в качестве исходного сырья использовали свиной инсулин. От очищенного свиного инсулина отщепляли С-концевой октапептид В-цепи, после чего синтезировали С-концевой октапептид человеческого инсулина. Затем его химически присоединяли, снимали защитные группы и очищали полученный инсулин. При тестировании данного метода получения инсулина было показана полная идентичность полученного гормона инсулину человека. Основной недостаток данного способа заключается в высокой стоимости получающегося инсулина (даже сейчас химический синтез октапептида - дорогое удовольствие, тем более в промышленном масштабе).  
В настоящее время инсулин человека, в основном, получают двумя способами:модификацией свиного инсулина синтетико-ферментативным методом и генно-инженерным способом.  
В первом случае метод основан на том, что свиной инсулин отличается от инсулина человека одной заменой на С-конце В-цепи Ala30Thr. Замену аланина на треонин осуществляют путем катализируемого ферментом отщепления аланина и присоединение вместо него защищенного по карбоксильной группе остатка треонина, присутствующего в реакционной смеси в большом избытке. После отщепления защитной О-трет-бутильной группы получают инсулин человека. (рисунок 1)

 

Способы  получения инсулина человека

 

модификацией свиного инсулина генно-инженерный

синтетико-ферментативным методом