Поскольку большинство микроорганизмов не обладают собственной люминесценцией существует несколько способов их обработки  для наблюдения в флуоресцентном микроскопе. Прежде всего, это флуорохромирование - окрашивание сильно разведенными (до нескольких микрограмм/мл) растворами флуоресцирующих красителей (флуорохромов). Флуоресцентная микроскопия по сравнению  с обычной позволяет:

• сочетать цветное изображение и контрастность объектов;
• изучать морфологию живых и мертвых клеток микроорганизмов в питательных средах и тканях животных и растений;
• исследовать клеточные микроструктуры, избирательно поглощающие различные флуорохромы, являющиеся при этом специфическими цитохимическими индикаторами;
• определять функционально-морфологические изменения клеток;
• использовать флуорохромы при иммунологических реакциях и подсчете бактерий в образцах с невысоким их содержанием.

     Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия позволяет  изучать как собственную (первичную) флюоресценцию ряда веществ, так  и вторичную флюоресценцию, вызванную  окрашиванием клеточных структур специальными красителями — флюорохромами.

     Принцип метода состоит в том, что некоторые  вещества при световом облучении  начинают светиться сами. Для возбуждения  флюоресценции в видимой части  спектра обычно пользуются синим  светом или ультрафиолетовыми лучами.

     Многие  вещества, не флюоресцирующие в видимой  области (в особенности нуклеиновые  кислоты), при освещении ультрафиолетовыми  лучами начинают флюоресцировать и  могут выявляться без применения флюорохромов.

     К вторичной флюоресценции относится  иммунофлюоресценция, основанная на взаимодействии иммунного белка с флюорохромами. 

     Ультрафиолетовая микроскопия 

     Ультрафиолетовая микроскопия, основанная на способности некоторых веществ избирательно поглощать  ультрафиолетовые лучи с определенной длиной волны, принципиально почти ничем не отличается от обычной световой  микроскопии  и осуществляется при помощи микроскопов с кварцевой или отражательной (зеркальной) оптикой. Изображение рассматривается на флюоресцирующем экране визуально, а также фотографируется.

     Микроскопирование объектов позволяет выявить исследуемые  вещества, не применяя окрашивания.

     Поскольку крайний предел разрешения, достижимый с наилучшей линзой, равен половине длины волны применяемого света, единственным возможным путем увеличения разрешения может быть использование  света более коротких длин волн, чем видимый.

     Таким светом является ультрафиолетовое излучение. Длина волны зеленого света составляет 5000 А. Из соображений, обусловленных  источниками света и используемыми  для линз материалами, самый коротковолновый  реально применимый на практике ультрафиолетовый свет — это мощное излучение ртутной  дуги, длина волны которого очень  близка к 2500

     А, т. е. как раз к половине длины  волны зеленого света. В самом  лучшем случае использование этого  ультрафиолетового света может  только удвоить ра-зрешающую способность; достижение не такое уж значительное, тем не менее достаточно желательное.

     Однако  существует иное и, может быть, большее  основание пользоваться ультрафиолетовым светом в микроскопии, оеобенно в  применении к биологическим объектам.

     Было  найдено, что различные участки  образца могут (на самом деле это  совсем но редкий случай) логлощать  ультрафиолетовый свет по-разному. Вследствие этого прохождение света через объект может выявить совершенно новые контрасты и обнаружить области различной структуры при условии, что существует какое-нибудь устройство, позволяющее наблюдателю «увидеть» ультрафиолетовое изображение.

     В наше время ультрафиолетовые микроскопы изготовляются оптической промышленностью.

     При этом «приходится решать три задачи.

     Необходимо создать безвредные для здоровья интенсивные источники ультрафиолетового излучения, которые не излучали бы видимого света; в противном случае видимый свет будет маскировать искомые эффекты.

     В настоящее время этой цели служит ртутная дуга в кварцевой оболочке, поскольку кварц прозрачен в  требуемой области длин волн (обычное  стекло для такого света непрозрачно).

       Источник помещается в контейнер  из специального стекла, которое  обладает нужным свойством задерживать  видимый свет, но пропускать значительную  часть ультрафиолета. 

     Метод чисторадиографии 

     Метод чисторадиографии основан на действии излучений, испускаемых радиоизотопами, на фотопластинку. Он применяется как один из способов качественного и количественного определения радиоактивности горных пород и минералов.

     Различают две разновидности метода: обычную, или контрастную, радиографию и следовую, или микроавторадиографию. При обычной радиографии изучаемый образец отшлифовывается, накладывается на эмульсию фотопластинки, закрепляется на ней и экспонируется в темноте в течение определенного времени, зависящего от активности образца.

     Чем выше радиоактивность образца, тем  интенсивнее (после проявления) почернение фотопластинки. Такая радиография дает возможность решить вопрос о распределении в образце радиоактивных элементов и оценить их суммарное содержание путем сравнения с эталонным образцом. В контрастной радиографии используется действие α-, β- и отчасти γ-излучения.

     Способность сильно ионизирующих α-частиц оставлять  в проявленной пластинке четкие прямолинейные следы (треки), видимые под микроскопом примерно при 500-кратном увеличении, используется в микроавторадиографии.

     Для трековой авторадиографии используются специальные фотопластинки с  толстым слоем эмульсии (не менее 50 мкм) и большой концентрацией бромистого серебра, не чувствительные к β- и γ-излучению, но четко фиксирующие α-частицы различных энергий, а следовательно, различных пробегов R. Определение пробегов необходимо для изучения природы радиоактивности и раздельного измерения урана и тория. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

     Вопрос 2

 

     Способы деления  клеток. Сходства и различия митотического, редукционного и  эквационного деления клетки. Приведите примеры клеток, размножающихся посредством указанных видов деления. Ответ иллюстрируйте рисунками 
 

     Деление клеток - основа размножения и индивидуального  развития организмов. Жизненный цикл клетки. Митотический цикл клетки, митоз (амитоз).

     Жизнь клетки завершается делением или, как  у многоклеточных организмов, старением  и смертью. Только благодаря способности  воспроизводить себе подобных осуществляется преемственность и непрерывность  жизни на Земле. В основе размножения  и индивидуального развития организмов лежит непрерывная серия клеточных  делений.

     Способы деления клеток представлены в схеме:

     

     Результат деления клетки - появление двух дочерних из одной материнской. Этот процесс циклически повторяется, совершаясь через строго определенное время. Разные виды клеток обладают разной скоростью  и способностью к делению.

     Время существования клетки от деления к делению называют жизненным циклом клетки.

     Перед изучением этой темы повторите содержание понятий: ДНК, хромосомы, хроматиды, клеточный центр, кариотип, гомологичные хромосомы, постоянство числа хромосом.

     Клеточный цикл эукариот состоит из интерфазы и мтоза. В период интерфазы в клетке происходят следующие процессы:

     1) удвоение хромосом - редупликация  ДНК (удвоенная хромосома состоит из двух хроматид, каждая из которых содержит одну молекулу ДНК).

     2) биосинтез белков, накопление АТФ, Удвоение важнейших структур клетки.

     Вслед за интерфазой наступает относительно короткий период в жизни клетки при  котором происходит равномерное  распределение хромосом и цитоплазмы по двум дочерним клеткам - МИТОЗ.

     Митоз представляет собой сложное деление  с образованием специального аппарата для равномерного распределения  хромосом по дочерним клеткам (митотического  веретена). В митозе условно можно  выделить несколько последовательных фаз: профаза, метафаза, анафаза, телофаза.

     Биологическое значение митоза заключается в том, что он обеспечивает постоянство  числа хромосом во всех клетках организма. В процессе митоза происходит распределение  ДНК хромосом материнской клетки строго поровну между возникающими из нее двумя дочерними клетками. В результате митоза все клетки тела, кроме половых, получают одну и ту же генетическую информацию. Такие  клетки называются соматическими (от греч. "сома" - тело).

     Митотическое  деление клеток (митоз) приводит к увеличе­нию числа клеток, росту организма. Таким способом обеспечи­вается обновление клеток при их износе, гибели. В настоящее время известно, что клетки эпидермиса живут 10-30 дней, эритроциты - до 4-5 мес. Нервные и мышечные клетки (во­локна) живут в течение всей жизни человека. У всех клеток при размножении (делении) наблюдаются из­менения, укладывающиеся в рамки клеточного цикла. Клеточ­ным циклом называют процессы, которые происходят в клетке от деления до деления или от деления до смерти (гибели) клет­ки. В клеточном цикле выделяют подготовку клетки к делению (интерфаза) и митоз (процесс деления клетки).

     В интерфазе, которая длится примерно 20-30 ч, ско­рость биосинтетических процессов  возрастает, увеличивается количество органелл. В это время удваивается  масса клетки и всех ее структурных  компонентов, в том числе центриолей. Происходит репликация (повторение, удвоение) молекул нуклеиновых кислот. Этот процесс пе­редачи генетической ин­формации, хранящейся в родительской ДНК, пу­тем точного ее воспроиз­ведения в дочерних клет­ках. Родительская цепь ДНК служит матрицей для синтеза  дочерних ДНК. В итоге реплика­ции  каждая из двух дочерних молекул ДНК  состоит из одной старой и одной  новой цепей. В период подготовки к митозу в клетке синтезируются  белки, необходимые для деления  клетки. К концу интерфазы хроматин в ядре конденсирован.

     Рис. 1. Схема митотического деления клетки: а — начало профазы; б — конец профазы; в — метафаза; г — анафаза; д — телофаза; е — завершение митоза. 1 — ядро; 2 — ядрышко; 3 — ядерная оболочка; 4 — неспирализованные хромосомы; 5 — пара центртриолей; 6 — нити веретена деления; 7 — родительские хромосомы разных типов; 8 — центромеры хромосом; 9 — дочерние хромосомы; 10 — поперечная мембранная перегородка между дочерними клетками.

     Мейоз (или   редукционное деление клетки) — деление ядра эукариотической клетки  с уменьшением числа хромосом  в два раза. Происходит в два этапа (редукционный и эквационный этапы мейоза). Мейоз не следует смешивать с гаметогенезом — образованием специализированных половых клеток, или гамет, из недифференцированных стволовых.

     С уменьшением числа хромосом в  результате мейоза в жизненном цикле  происходит переход от диплоидной фазы к гаплоидной. Восстановление плоидности (переход от гаплоидной фазы к диплоидной) происходит в результате полового процесса.

     В связи с тем, что в профазе  первого, редукционного, этапа происходит попарное слияние (конъюгация) гомологичных хромосом, правильное протекание мейоза возможно только в диплоидных клетках  или в чётных полиплоидах (тетра-, гексаплоидных и т. п. клетках). Мейоз  может происходить и в нечётных полиплоидах (три-, пентаплоидных и  т. п. клетках), но в них, из-за невозможности  обеспечить попарное слияние хромосом в профазе I, расхождение хромосом происходит с нарушениями, которые  ставят под угрозу жизнеспособность клетки или развивающегося из неё  многоклеточного гаплоидного организма.

     Этот  же механизм лежит в основе стерильности межвидовых гибридов. Поскольку у  межвидовых гибридов в ядре клеток сочетаются хромосомы родителей, относящихся  к различным видам, хромосомы  обычно не могут вступить в конъюгацию. Это приводит к нарушениям в расхождении  хромосом при мейозе и, в конечном счете, к нежизнеспособности половых  клеток, или гамет. Определенные ограничения  на конъюгацию хромосом накладывают и хромосомные мутации (масштабные делеции, дупликации, инверсии или транслокации).