Сложный метод окрашивания

Сложный метод окрашивания заключается  в том, что применяются несколько растворов красителей и реактивов. Они позволяют, помимо морфологии бактерий, определить их тинкториальные особенности (различное окрашивание при использовании специальных методов) и наличие (или отсутствие) структурных элементов клетки (капсула, спора), что имеет важное дифференциально-диагностическое значение.

Одним  из таких является окрашивание по Граму: на фиксированный препарат на 2-3 мин накладывают небольшую полоску фильтровальной бумаги, пропитанную карболовым генцианвиолетом. После этого, не смывая водой, бумажку снимают и на мазок наносят раствор Люголя на 2-3 мин. Последний, также не промывая водой, сливают, мазок обрабатывают (наливают на него) 96%-ным спиртом 30-40 с, затем хорошо промывают водой и дополнительно окрашивают  рабочим раствором фуксина 40-50 с(до 1 мин). Вновь промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой, микроскопируют, видимую куртину зарисовывают.

По результату окрашивания данным методом бактерии делят на грамположительные и грамотрицальные. Микроорганизмы, сохранившие первичную фиолетовую окраску (несмотря на воздействие спиртом и доп окраску фуксином), называются грамположительными (микробы сибирской язвы, рожи свиней, злокачественного отека, стафилококки и др), а бактерии, которые обесцвечиваются спиртом, а затем принимают цвет доп окраски фуксином (розово-красный), - грамотрицательными (эшерихии, сальмонеллы, пастереллы и др).  В лаборатории при окраске по Граум часто используют модификацию Синева, вместо жидкой краски генцианвиолета используют фильтровальную бумагу, пропитанную насыщенным спиртовым раствором этой краски, что обеспечивает лучшую сохранность красителя и уменьшает его осадок на мазке.

Разная окраска грамполож и грамотрицат бактерий объясняется  различным строением их оболочек, точнее, клеточной стенки, которая по сравнению с грамотрицат бактерии у грамполож толще, содержит много полимера пептидогликана, прочно удерживает генцианвиолет, не обесцвечивается спиртом за 30-40 с. у грамотрицат бактерий клеточная стенка тоньше, содержит меньше пептидогликана, слабее реагирует с красителем и поэтому обесцвечивается спиртом.

К сложным (специальным)  методам относят методы окраски спор. Споры бацилл обладают высокой устойчивостью к высушиванию, нагреванию, к обработке кислот и щелочей, что объясняется особым строением и хим. Составом споры, в особенности ее оболочки. Поэтому споры стойки и к действию красителей.

Все методы окраски спор основаны на обеспечении проникновения красителя через трудноокрашиваемую оболочку споры. Поэтому применяют протравку (хромовая кислота разрыхляет оболочку), а подогревание делает ее еще более проницаемой для горячего фуксина с протравителем фенолом. После охлаждения оболочка вновь становиться плотной, не пропускает серную кислоту и дополнительный краситель.

 Метод Меллера. Фиксированный мазок протравляют 5%-ной хромовой кислотой 2-3 минуты, промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой, окрашивают карболовым фуксином. Во избежание попадания осадка краски, на мазок предварительно накладывают листок фильтровальной бумаги, а на него уже наносят краску. Препарат внизу подогревают до появления паров, окрашивают 7-8 мин, краску с листком бумажки сливают, не промывая водой, обрабатывают 5%-ным раствором серной кислоты 5-7с, хорошо промывают водой и доп окрашивают метиловой синью 4-5 мин. Вновь промывают водой, просушивают фильтровальной бумагой, микроскопируют- споры окрашиваются в розово-красный цвет, вегетативные клетки – в синий.

 Метод Златогорова отличается от предыдущего лишь тем, что препарат не обрабатывают хромовой кислотой. Результат окрашивания тот же (споры-красные, вегетативные клетки – синие).

Метод Пешкова. Мазок фиксируют, окрашивают метиловой синью с подогреванием до кипения, затем смывают водой, докрашивают 1%-ным раствором нейтрального красного 10с, смывают водой, высушивают фильтровальной бумагой. Споры-синий цвет, вегетативные клетки – красный.