Селекция микроорганизмов.

                                                                   Селекция микроорганизмов. 
 

Согласно общепринятому определению, Генетика) микроорганизмов, раздел общей генетики, в котором объектом исследования служат бактерии, микроскопические грибы, актинофаги, вирусы животных и растений, бактериофаги и др. микроорганизмы. До 40-х гг. 20 в. считалось, что, поскольку у микроорганизмов нет ядерного аппарата и мейоза, на них не распространяются Менделя законы и хромосомная теория наследственности. С начала 40-х гг. микроорганизмы становятся объектом интенсивных генетических исследований. Именно на них были решены многие кардинальные вопросы современные генетики. Так, первое указание на то, что материальным носителем наследственности служит дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК (было получено в опытах на пневмококках (американские генетики О. Т. Эйвери, К. Мак-Леод и М. Маккарти). Примерно в то же время были начаты интенсивные генетические исследования на хлебной плесени - нейроспоре. Изучение многочисленных биохимических мутантов нейроспоры (Дж. У. Бидл и Э. Л. Тейтем США привело к установлению очень важного положения: "один ген - один фермент" (ныне это положение более точно формулируется так: "один ген - одна полипептидная цепь"). Генетические (исследования микроорганизмов особенно интенсивно стали развиваться после того, как американские генетики С. Лурия М. Дельбрюк показали на кишечной палочке (Escherichia coli), что и бактерии подчиняются мутационным закономерностям (см. Изменчивость Мутации Ранее существовавшее представление об адекватной, адаптивной изменчивости у бактерий возникло вследствие методической ошибки, заключавшейся в изучении культуры как единицы изменчивости. Был предложен новый принцип изучения изменчивости у бактерий - клональный анализ, т. е. изучение потомства одной клетки - родоначальницы клона. Важной вехой в развитии Г. м. явился разработанный американскими генетиками Дж. и Э. Ледербергами метод реплик, или отпечатков, позволивший доказать, что мутации возникают у бактерий независимо от условий культивирования, и, кроме того, значительно упростивший приёмы отбора вариантов микроорганизмов с желаемыми свойствами. Оказалось, что в больших популяциях бактериальных клеток мутации возникают спонтанно. В 1946 был открыт половой процесс у бактерий (конъюгация), что позволило применить для их исследования генетический анализ. В результате установлены наличие у бактерий рекомбинации, существование у них генетических групп сцепления и построены генетические карты их хромосом. Почти одновременно был открыт парасексуальный процесс грибов (Г. Понтекорво Великобритания), что расширило возможности генетического анализа грибов, не имеющих полового цикла размножения. Вскоре в генетические исследования были вовлечены бактериофаги и др. вирусы (в частности, вирус табачной мозаики - ВТМ). Был открыт эффект переноса генетической информации от одной бактериальной клетки к другой при посредстве бактериофага - генетической трансдукция, что положило начало изучению генетических взаимоотношений в системе "фаг - бактерия" (Дж. Ледерберг, Н. Зиндер, США (см. Вслед за тем была обнаружена рекомбинация у фагов (А. Херши и М. Дельбрюк, США (смЕсли использование бактерий в качестве объекта генетических исследований резко повысило разрешающую способность генетическиого анализа, то благодаря фагам удалось перейти к изучению явлений наследственности на молекулярном уровне. Большое значение имели исследования ВТМ (немецкие генетики Г. Шустер и А. Гирер), позволившие вызвать генетический эффект в опытах с чистой рибонуклеиновой кислотой (РНК (которая сохраняла инфекционность и при нанесении на листья табака вызывала в клетках образование полноценных частиц ВТМ. Исходя (см. из общих принципов исследования генетических процессов у микроорганизмов, для каждой группы разработаны специальные методы изучения с учётом их особенностей. Генетические) механизмы у грибов и водорослей, сохранивших половой процесс, имеют ряд особенностей. Главная из них состоит в том, что продукты мейоза (споры) остаются соединёнными в определенном порядке, и после раздельного высева этих спор можно непосредственно изучать генотип каждого продукта мейоза. Этот метод, называемый тетрадным анализом, дополняет статистические методы изучения процесса расщепления. Применение генетич??????? еского анализа к организмам, у которых отсутствует половой процесс, стало возможным после открытия у них парасексуальных процессов, отличающихся большим разнообразием. Так, у несовершенных грибов при срастании гиф, принадлежащих двум генетически различным штаммам, происходит объединение и затем слияние двух гаплоидных ядер в одно диплоидное; в этой системе изредка возможен обмен генетическим материалом. Особенность полового процесса у бактерий состоит в том, что в клетку-реципиент передаётся, как правило, только часть генетического материала из клетки-донора, в результате чего образуется частично диплоидная зигота (т. н. мерозигота). У бактерий известно несколько механизмов передачи генетического материала. Наиболее (см. Наиб) совершенная форма полового процесса у бактерий - конъюгация, детально изученная у кишечной палочки. Конъюгация (см. Конъюгация) происходит при непосредственном контакте между двумя клетками, если в одной из них присутствует специфический половой фактор, или фактор скрещиваемости (фертильности, плодовитости), половой фактор (см. Эписомы (см. Эписомы)) содержит ДНК (см. ДНК) и может существовать в клетке либо автономном, либо в интегрированном состоянии (включенным в первом случае при конъюгации в клетку-реципиент переходит только половой фактор. Во втором случае половой фактор способствует направленному переносу генетического материала из клетки-донора в клетку-реципиент. Как правило, при этом происходит передача только части генома донора и лишь крайне редко передаётся вся хромосома донора вместе включенным в неё половым фактором. Между фрагментом донорной ДНК (см. ДНК) и ДНК (см. ДНК) реципиента может произойти обмен гомологичными генетическими участками - кроссинговер, приводящий к возникновению рекомбинантов, т. е. клеток с изменённым сочетанием признаков. Генетический (см. Ген) анализ рекомбинантов кишечной палочки позволил установить у неё существование одной группы сцепления, определить линейное расположение большого числа генов в её хромосоме и построить кольцевую генетическую карту (см. Генетические (см. Ген) карты хромосом). Перенос (см. Перенос) генетического материала при конъюгации - строго ориентированный процесс, при котором последовательность передачи генов (а значит, и вероятность их участия в кроссинговере) целиком зависит от расположения генов в хромосоме и точки интеграции (включения) полового фактора. При переходе полового фактора в автономное состояние гены, расположенные на хромосоме рядом с точкой интеграции, могут объединиться с половым фактором и в дальнейшем передаваться с ним как единое целое, превращая клетки-реципиенты в диплоиды по данному генетическому участку. Этот процесс переноса генов совместно с половым фактором, называется сексдукцией, также может привести к возникновению рекомбинантов. Др. механизм возникновения рекомбинантов у бактерий - трансдукция - осуществляется при посредстве т. н. умеренных бактериофагов, которые способны к особому виду симбиоза с бактериями - лизогении. В лизогенных бактериях ДНК (см. ДНК) умеренного фага интегрирована с ДНК (см. ДНК) бактериальной клетки и реплицируется одновременно с ней. Такая скрытая форма присутствия фага (профаг) может сохраняться в течение многих клеточных поколений, однако изредка профаг переходит в вегетативное состояние (т. е. начинает размножаться) и разрушает бактерию. При этом возможны захват небольшого фрагмента ДНК (см. ДНК) клетки-хозяина и последующий его перенос в др. клетку, в которой перенесённый участок генома может вступить в генетический обмен с гомологичной областью клетки-реципиента. Обычно при трансдукции прогены, расположенные в непосредственной близости от места локализации профага в хромосоме бактерии. Однако некоторые фаги осуществляют трансдукцию, при которой любой участок генома бактерии с равной вероятностью может быть перенесён в др. клетку. Иногда сам процесс лизогенизации, т. е. включения умеренного фага в геном бактерии, может сопровождаться приобретением клеткой новых свойств (см. Лизогенная конверсия (см. Лизогенная конверсия)), например вирулентности. Ещё один тип полового процесса у бактерий, называемый трансформацией, - перенос генетического материала без посредства полового фактора или умеренного бактериофага с последующим возникновением рекомбинантов (вследствие генетического обмена между проникшим в клетку фрагментом ДНК (см. ДНК) и ДНК (см. ДНК) клетки-реципиента). Особенности генетических механизмов у вирусов бактерий - бактериофагов- делают их весьма удобной моделью для изучения воспроизведения и функционирования генетического материала. Они (см. Они) очень просто устроены, быстро размножаются и имеют очень короткий жизненный цикл; поэтому генетика бактериофагов, в особенности фагов Т2, Т4 и l, исследована весьма детально. Бактериофаги (см. Бактериофаги) скрещивают, заражая бактерии сью двух или нескольких мутантов фага. В этом случае, кроме исходных фаговых частиц, появляются рекомбинанты с измененными сочетаниями признаков. С помощью рекомбинационного анализа удалось построить генетические карты для ряда бактериофагов. Оказалось, что молекула ДНК (см. ДНК) фага является его хромосомой. Изучение тонкой структуры гена, проведённое на фаге Т4 (С. Бензер, США (см. США)), показало существование большого числа участков внутри гена, способных изменяться (мутировать) с разной частотой под действием различных мутагенов.Генетика (см. Генетика) (см. Ген) вирусов животных и растений в значительной мере основывается на успехах в области генетики бактериофагов, но из-за технических трудностей еще не получила достаточного развития. Возможность получения рекомбинантов была показана у ДНК (см. ДНК)-содержащих вирусов группы оспы - осповакцины (при шанном заражении клеток различными представителями этой группы), у вируса герпеса (между различными вариантами этого вируса), а также, между обезьяньим опухолеродным вирусом SV40 и различными представителями аденовирусов. У РНК (см. РНК)-содержащих вирусов животных показана возможность получения рекомбинантов между мутантами вируса ящура и полиомиелита, а также между различными вариантами вируса гриппа. Последнее (см. Послед) открытие имеет особое значение, т. к. показывает возможные пути изменчивости этого вируса в природе. Из вирусов растений лучше всего изучен вирус табачной мозаики (ВТМ). В частности, полностью расшифрована последовательность аминокислот в белке ВТМ; удалось установить характер аминокислотных замещений, возникающих в белках оболочки у разных мутантов ВТМ. Работы, выполненные на ВТМ, явились важным этапом в изучении как механизма мутагенеза, так и природы генетического кода.В связи с развитием новой отрасли народного хозяйства - микробиологической промышленности - возникла прикладная Г. м., называется также селекцией и микроорганизмов. В сферу исследований были вовлечены новые формы микроорганизмов: пенициллы (Penicil humchrysogenum), актиномицеты (Actinomyces streptomycini, Act. rimosus и др.), актинофаги. У пенициллов и аспергиллов открыт парасексуальный процесс, у актиномицетов изучен механизм рекомбинации, открыты генетическая рекомбинация у актинофагов, генетическая трансдукция у актиномицетов. Проведены обширные исследования индуцированной изменчивости количественных признаков у актиномицетов.В Советском Союзе в работе по селекции микроорганизмов применяются такие генетические методы, как получение индуцированных мутаций, гибридизация и заражение актиномицетов актинофагами. В итоге выведены высокоактивные штаммы, позволившие во много раз увеличить производство антибиотиков, аминокислот, витаминов и др. биологически активных веществ.В связи с возрастающим значением Г. м. и необходимостью развития микробиологической промышленности в 1968 в Москве был организован Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Главмикробиопрома, ставший ведущим научным центром в этой области. Проблемы генетики и селекции микроорганизмов разрабатываются и в др. научных учреждениях Москвы (Институт) эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи АМН ССС), институт общей генетики и институт атомной энергии им. И. В. Курчатова АН ,Ленинграда) (Физико-технический институт () им. А. Ф. Иоффе АН СССР), кафедра генетики ЛГУ), Киева), Еревана и др. Г. м. сыграла важную роль в развитии современный генетики, дополнив ряд положений генетики высших организмов. Г. м., в свою очередь, стала основой для развития молекулярной генетики. Лит.: Хэйс У., бактерий и бактериофагов, пер. с англ., М., 1965; Гольдфарб Д. М., Введение в генетику бактерий, М., 1966; Захаров И. А. и Квитко К. В. Генетика (см. микроорганизмов, Л., 1967; Алиханян С. И., Современная генетика, М., 1967, его же, Селекция  промышленных микроорганизмов, М., 1968; Браун (В., Генетика (см. микроорганизмов, Л., 1967; Алиханян С. И., Современная генетика, М., 1967; его же. Селекция  промышленных микроорганизмов М., 1968; Браун , Генетика бактерий, пер. с англ., М., 1968; Генетические основы селекции микроорганизмов, М., 1969.? С. И. Алиханян), А. Н. Майсурян.

Пенициллиновая методика селекции

Мы рассмотрим один из этих способов — пенициллиновую методику селекции микроорганизмов. Эта методика основана на специфической особенности действия антибиотика пенициллина на чувствительные к нему микроорганизмы. Он убивает все клетки, активно совершающие обмен веществ, и не оказывает летального действия на клетки, находящиеся в состоянии анабиоза (что у ауксотрофных микроорганизмов имеет место при отсутствии в питательной среде необходимых для них ростовых веществ).

Кратко эта  методика может быть описана следующим образом. Чувствительные к пенициллину прототрофные микроорганизмы после обработки их мутагенными факторами высевают в жидкую минимальную питательную среду, в которую добавлен пенициллин в летальной для них концентрации, и выдерживают в течение 24 ч в термостате при оптимальной для них температуре. За этот срок все способные совершать обмен веществ и размножаться на этой среде прототрофные микроорганизмы умерщвляются пенициллином, в то время как ауксотрофные мутанты, неспособные совершать обмен веществ из-за отсутствия необходимых для них веществ, находятся в состоянии анабиоза и сохраняют жизнеспособность. После удаления пенициллина микроорганизмы высевают в чашки Петри с плотной полной питательной средой, где сохранившие жизнеспособность клетки ауксотрофных мутантов делятся и дают начало колониям, которые состоят из клеток, потерявших способность к синтезу одного из веществ (т. е. из клеток ауксотрофных мутантов). От этих колоний делают отсевы в пробирки с полной питательной средой, а потом проверяют образующиеся в пробирках культуры при помощи рутинной методики, в каких именно веществах они нуждаются.