Производство витамина В12

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ВИТАМИНА В12

О.В. Мосин

Витамин В12, или цианкобаламин, — важное биологическое соединение, активный гематопоэтический фактор млекопитающих и ростовой фактор для многих видов микроорганизмов и животных.

Начало истории витамина B12 положили исследования злокачественного малокровия (пернициозной анемии) — заболевания, поражающего в основном пожилых людей, но наблюдаемое иногда и у детей.

До 1926 г. это заболевание было неизлечимым и обычно кончалось смертью. При этом заболевании в организме вырабатываются аномально большие, недоразвитые и нестойкие эритроциты, общее количество которых значительно снижалось (1x106—3xЮ6 мм~3 вместо 4,5x106—6x106 мм~3). Заболевание поражает также и другие быстрорастущие ткани, например слизистую оболочку желудка (в результате прекращается секреция НСl) и нервные ткани. При этом часто наблюдается демиелинизация центральной нервной системы с нарушением координации движений (атаксия) и психотическими расстройствами. Внутримышечное   введение   3-6 мкг витамина B12 достаточно, чтобы вызвать ремиссию у пациента, больного перницитозной анемией.

В 1926 г. Мино и Морфи обнаружили, что с пернициозной анемией можно справиться, если употреблять в пищу сырую или слегка поджаренную печень из расчета 1/4 кг в день. И только 22 годами позднее из печени крупного рогатого скота были выделены первые красные кабальтсодержащие кристаллы витамина B12. Позже выяснилось, что более богатым источником витамина могут служить жидкие ферментационные среды бактерий.

Структура витамина B12 была впервые определена в 1956 году Дороти Ходжкин методом дифракции рентгеновских лучей. Это была самая крупная органическая молекула, структуру которой удалось определить методами рентгено-структурного анализа. Циклическая система витамина B12 подобна циклической системе порфиринов (рис. 1); она состоит из четырех пиррольных колец с атомом кобальта в центре.

Нормальный уровень витамина B12 в крови составляет ~2-10~-10 M или немного выше, однако у вегетарианцев этот уровень может опускаться ниже половины этой величины. Недостаточность фолиевой кислоты также может вызывать, мегалобластическую анемию, а большой избыток фолиевои кислоты может в некоторой степени уменьшить анемию у пациентов, больных злокачественным малокровием.

В тканях животных концентрация витамина очень низкая (в печени быка —1 мг/кг), чтобы использовать этот источник для промышленных целей. Активированный ил сточных вод содержит 4—10 мкг/кг витамина, но при этом требуется разделение большого числа различных форм (аналогов).

Химический синтез витамина В12 очень сложен. Больше 10 лет потребовалось сотрудникам двух больших лабораторий — Вудворта и Эшенмозера для осуществления химического синтеза витамина В12, включающего 70 стадий. Поэтому в настоящее время витамин В12 в промышленности получают исключительно биосинтетическим путем. Из 10 тонн ежегодно выпускаемого в мире витамина B12 3,5 т приходится на цианкобаламин (собственно витамин B12), 2 т на гидроксокобаламин, 1т — на коэнзим В]2 и небольшое количество на метилкобаламин; эти формы в указанных  количествах  используют  в  медицине.  Остальное количество витамина используется для животноводства.

Витамин B12 применяют при лечении злокачественной анемии, цирроза печени, при нервных и психических расстройствах. Он широко используется в производстве кормов. В настоящее время большинство комбикормов для свиней и птиц обогащают витамином В12, особенно благоприятное действие на животных оказывает сочетание витамина B12 с малыми дозами антибиотиков, в частности биомицина. Витамин В12 воздействует на кроветворную функцию и на обмен белков, принимает участие в регуляции оптимального содержания в организме животного метионина, валина, треонина, лейцина, изолейцина.

У птиц снижение содержания B12, в желтке яиц приводит к резкому падению выводимости потомству. При добавлении В12 в корма (10—15 мг/т) прирост поросят увеличивается на 10—15%, цыплят — до 20%, яйценоскость кур — со 180 до 208 яиц в год. При добавлении Bi2 к кормам можно заменить животный белок растительным. Отечественная микробиологическая промышленность выпускает витамин B12 двух марок: А—200 мг/кг, В — не менее 500 мг/кг препарата.

Люди получают витамин В12 с пищей и не могут усваивать витамин, выделяемый бактериями кишок. Животные получают витамин В12 с кормом и утилизируют витамин, образуемый кишечной микрофлорой.

Молекулярная структура. Витамин B12 - первое органометаллическое соединение, выделенное из биологической системы. Из неполимерных органических соединений имеет наиболее сложное строение, изображенное на рисунке. Молекула состоит из двух почти планарных циклических структур и линейного участка. Металл Со+3 связан с макроциклом, сильно напоминающим порфириновое ядро гема. Это тетрапиррольная структура, но имеющая ту особенность, что вместо метановых мостиков, связывающих 4 пиррольных кольца, кольца А и D непосредственно связаны. Вторая кольцевая структура — азотистое основание — 5,6-диметилбен-зимидазол (5,6 ДМБ}. 5,6 ДМБ соединен с первой кольцевой системой гетерогенной боковой цепью, состоящей из N-амино-2-пропанола (изопропанола), этерифицированного фосфатом 3-мононуклеотида, связанного с основанием 5,6 ДМБ Na-гликозидной связью.

 

 

 

 

 

 

 

 

Структура витамина В12 не только очень сложная, но содержит некоторые необычные части: 1) корриновая структура ранее не была известна в органической химии (до открытия витамина В12 в 1948 г. независимо Риксом и Смитом); 2) Na-гликозидная связь встречается в природе очень редко и обнаружена лишь в нескольких соединениях, содержащих рибозо-3-фосфат; 3) 5,6 ДМБ тоже принадлежит к уникальным соединениям и встречается в природе только в составе кобаламинов.

Атом кобальта имеет 6 координационных связей; 4 из них заняты пиррольными кольцами. Одна - N-3—5,6 ДМБ и последняя — верхним лигандом (У), природа которого может варьировать. В коммерческом    витамине    В12    (цианкобаламине)    лиганд -CN-группа (артефакт процесса выделения). 

In vivo чаще всего встречаются дезоксиаденозильная  группа   (Co-B12—I),  метильная группа   (метилкобаламии,   СН3—B12-CoB—II)     или    оксогруппа (оксокобаламин). Кроме этих соединений, известных как кобаламины, есть другие корриноидные соединения с иным нуклеотид-аным основанием.

Нижний лиганд (х) -5,6 ДМБ может быть заменен на аденин {псевдовитамин В12), на гуанин (фактор С), 2-метиладенин (фактор А) и др. Они могут проявлять активность для некоторых микроорганизмов, но неактивны для людей. Из всех витамин В12-подобных соединений только Со-В12—I и Со-В12—II (СНз—В12) активны на клеточном уровне и как кофакторы вовлекаются в катализ двух типов реакций. Аденозил B12 используется в реакциях, в которых имеет место перестройка углерод-углеродных связей. Метил В12 вовлекается в реакциях переноса метильных групп, например в синтезе метионина из гомоцистеина (Воробьева, 1982).

Недавно открыты новые аналоги витамина В12: три из них получены при частичном синтезе (фтор-метилфосфито-Р-кобаламид, диметилфосфито-Р-кобаламин, Fe-кобаламин) и один фактор VA выделенный из активного ила.

По сравнению с CN-кобаламином у них были модифицированы  либо  верхний  лиганд,    либо  центральный   атом   корринового кольца. Два фосфито-корриноида, содержащие Со-Р-связь, проявляют активность в микроорганизме Qchromonas malhamensis (реакция как у высших животных) для Е. coll 215 и животных. В отличие от них Fe-кобаламин и фактор VA проявляли очень низкую активность. Первые два аналога связывались с внутренним фактором (ВФ) животных (белок, участвующий в транспорте витамина bis), Другие два — нет. Значит, биологическая активность коррелирует со способностью связываться с ВФ.

Биосинтез. Путь биосинтеза витамина В12 включает три ступени образования:

1) порфиринового ядра;

2) корринового ядра;

3) кобаламинов.

Путь до уропорфирина III хорошо изучен в отличие от последующих ступеней от УПГ III к кобириновой кислоте.

В последние годы открыт ряд пигментированных интермедиатов — метилкорриноидов. Источником СНз-групп служит S-аденозилметионин. Диметилкоррифирин идентичен сирогидрохлорину (сирогему микробной сульфитредуктазы), следовательно, этот интермедиат и возможно другие коррифирины имеют витаминнезависимую биологическую функцию.

Образование кобаламина включает: амидирование семи карбоксильных групп корринового кольца, включение остатка изопропиламина (происходит из треонина), активацию кобипамида с участием GTP и с образованием GMP, включение нуклеотидного основания.

Включение атома кобальта в систему происходит вскоре после образования кобириновой кислоты. У бактерии Prop. shermanii все известные корриноиды, амидированные больше, чем кобириновая кислота, находятся в 5'-аденозильной форме. Аэробные и аэротолерантные формы синтезируют 5,6 ДМБ из рибофлавина через FMN. Для синтеза требуется кислород.

Анаэробы образуют 5,6 ДМБ другим путем, включающим глицин и метионин. 6-Аминолевулиновая кислота (6-АЛК) у аэробов образуется из глицина и сукцинил-СоА, а у анаэробов -из глутамата (как у растений).

Биосинтез витамина В12 у бактерий происходит двумя независимыми путями, но оба приводят к образованию 5'-дезоксиаде-нозилкобинамидгуанозипдифосфата и а-рибазол-5'-фосфата, являющихся субстратами для конечной стадии синтеза.

Из клеток мутанта Е. coli выделили 70S рибосомы, способные синтезировать витамин B12 в реакционной системе. Основным катализатором синтеза является белок 18L. Белки 5S RNA также катализировали синтез витамина. Витамин В12, синтезированный при участии изолированных рибосом, был биологически активным.

Гем оказывает ингибирующее действие на общие начальные пути синтеза корриноидов и порфиринов. Синтез витамина В12  регулируется на уровне монометилкоррифирина. Регуляция осуществляется с участием кобаламинов и аналогов, в которых 5,6 ДМБ замещен на аденин или метиладенин. Фактор В регулирующей активностью не обладает. На биосинтез витамина В12 пропионовыми бактериями стимулирующее действие оказывает ион NH4+; в его отсутствии клетки витамин не синтезируют. Глутамин и аспарагин могут заменить ион  NH4+.  Стимулятором   синтеза  B12 у микроорганизма Ps.  de-nitrifleans выступает бетаин (триметилглицин).

Продуценты. Витамин синтезируют многие бактерии. Дрожжи и мицелиальные грибы не образуют корриноиды. В организме человека и животных витамин B12 синтезируется исключительно бактериальной микрофлорой кишечника.

 

Таблица 1.  Образование витамина В12 различными штаммами

Штамм 

Источник углерода 

Выход, мг/л

 

Micromonospora sp. Nocardia rugo&a

Propionibacierium freudenreichii

Propionibaderium Khermanii

Propionibacterium  vannielii

Pseudomonas denitr if leans Streptomyces olivaceus

Смешанная культура метаногенных

бактерий Bacterium FM-O2T

Methanobacillus omelianskii

Protaminobacter ruber

Corynebacterium и

Rhodopseudomonas

Nocardia gardnerii 

глюкоза

глюкоза—тростниковая меласса

глюкоза

глюкоза

глюкоза

свеклосахарная меласса

глюкоза-лактоза

метанол

метанол метанол метанол н-парафины

гексаденан 

11,5 14 25

23—40 25 59

35

2,6 8,8

2,5 2,3

4,5

 

В табл. 1 перечислены микроорганизмы, которые в силу высокого уровня биосинтеза кобаламинов в разное время рассматривались как его потенциальные продуценты в промышленности. В настоящее время в промышленности используют в основном три штамма бактерий: Pseudomonas denitrificans, представителей рода Propioni-bacterium и метаногенные бактерии (смешанную культуру). Во всех случаях независимо от используемого штамма и условий культивирования в среду вводят ионы кобальта и часто 5,6 ДМБ. .Добавление таких предшественников корриноидов, как глицин, треонин, 6-АЛК и аминопропанол, может оказывать стимулирующее действие на витаминообразование.

 

ПОЛУЧЕНИЕ

Получение витамина В12 с помощью пропионовокислых бактерий

В настоящее время для получения витамина В12 используют следующие микроорганизмы Prop, freudenreichii ATCC 6207, Prop, shermanii ATCC 13673, Prop, shermanii BKM-103 и их варианты и мутанты. Наибольший интерес представляют штаммы, способные к самостоятельному синтезу 5,6 ДМБ. Поскольку синтез 5,6 ДМБ лучше происходит при доступе воздуха, осуществляют двустадийный процесс, в котором получают наиболее высокий выход продукта. На 1-й стадии культуру выращивают в анаэробных условиях до полной утилизации сахара. На 2-й стадии включают аэрацию, тем самым создавая условия для синтеза 5,6 ДМБ и превращения этиокобаламнна в дезоксикобаламин. Обе стадии осуществляют в двух разных ферментерах или в одном. Анаэробно выросшие клетки можно собрать путем центрифугирования и инкубировать густую суспензию на воздухе и, если нужно, в присутствии 5,6 ДМБ и цианида. Добавление ДМБ производят только во 2-й стадии ферментации (если бактерии не синтезируют его самостоятельно), поскольку в его присутствии образуются полные формы витамина, ингибирующие его синтез. Среда для ферментации обычно содержит глюкозу или инвертированную-мелассу (10—100 г/л), небольшие количества солей Fe, Mn и Mg, а также Со (10—100 мг/л), источники азота [(Nl-UhSCU]. В среду добавляют кукурузный экстракт (30—70 г/л), содержащий молочную и пантотеновую кислоты, усиливающие рост бактерий. Пантотеновую кислоту, стимулирующую также синтез витамина, рекомендуют вносить в среду дополнительно. Бактерии-культивируют при 30°, поддерживая рН на уровне 6,5—7,0 путем введения (NH4)OH. Ферментацию производят в ферментерах на 500 л, содержащих 340 л среды, инокулированных 7 л посевного материала. В первые 80 ч культура растет под небольшим давлением N2 и слабым перемешиванием (без аэрации), в следующие 88 ч включают аэрацию (2 м3/ч) и перемешивание. Возможны некоторые вариации в культивировании. Витамин В12 сохраняется в клетках бактерий, поэтому проводят его экстракцию: