Проект биолаборатории и технологическая карта производства пириформина

10. Чашки  Петри, колбы конические различной  емкости  

                      2.5.Описание технологического процесса.

         Коллекционно – поддерживающий пересев и маточная культура.

    Поддерживающие пересевы необходимы для содержания гриба в жизнеспособном состоянии. Культуру хранят в пробирках на косяках сусло-агара. [1:3]

                      Приготовление питательной среды суслоагар.

    Пивное сусло разбавляют дистиллированной водой до концентрации сахара 5-7%. К разбавленному суслу прибавляют 1,5-2% агар-агара и, перемешивая, нагревают на медленном огне до его расплавления. Готовую среду фильтруют и разливают в пробирки.

    Пробирки с суслом стерилизуют  при 0,5 атм 30 минут, после застывания  среды гриб пересевают иглой  стерильно в пламени спиртовки. При этом иглой с загнутым концом, с помощью которой кусочек среды с культурой переносится в новую пробирку. Гриб растят 5 суток при температуре 26^±3⁰С, после чего пробирки закрывают полунепроницаемым материалом (целлофаном, калькой, фильтровальной бумагой), завязывают и хранят в холодильнике при 5…10⁰С до 6 месяцев.

    Для работы следует применять культуру выращенную в чашках Петри. Для этого чашки Петри стерилизуют при 1 атм в течение часа, заполняют стерильной средой сусло-агара [1:3]. После застывания на поверхность среды, в центр чашки стерильно в пламени спиртовки иглой наносят кусочек культуры. Гриб растят пять суток при 26±3⁰С, культуру в чашках хранят в холодильнике до 2 месяцев. Для предотвращения высыхания среды чашки рекомендуется завернуть в плотную бумагу.

                                         Получение инокулята.

    Для инокулята пригодна среда, обедненная углеводами: 1%соевой муки, 2%глюкозы. Колбы объемом 0,5-1,0 литра стерилизуют при 1 атм в течение 0,5 часа, заполняют средой на 1/5 часть, закрывают ватно-марлевыми пробками и снова стерилизуют при 0,5 атм 30 минут. В стерильную среду, когда она остынет, вносят кусочек культуры из чашки Петри возле пламени спиртовки. Культуру растят на качалке (скорость 150-240 об/мин) при температуре 26±3⁰С. За это время в среде образуются мицелиальные клубки, которые затее распадаются на короткие гифальные тела. Готовый инокулят содержит до 10⁵ гиф/мл среды.

     Потребность инокулята для засева культуры – 5% от объема инокулируемой среды, стартовый титр при этом составляет от 10³ до 5х10³ гиф/мл.

                                              Культивация

     Культивация проводится в ферментере. При его отсутствии несложно изготовить заменитель из стеклянной бутыли объемом 10 литров и более. Для хорошей аэрации по размеру горловины емкости изготавливается резиновая пробка, с тремя отверстиями. Одно отверстие (Ø20-30мм) необходимое для инокуляции, два других Ø 10-15 мм – для подачи и отсоса или кислорода. Посевное отверстие закрывается резиновой пробкой, к воздуходувным подводятся гибкие шланги по диаметру. Воздух подается и отсасывается через микробиологические фильтры для предотвращения заноса посторонней микрофлоры.

        Для культивирования готовится среда, состоящая из 1% соевой муки и 5% глюкозы. При использовании заменителей сои или глюкозы необходимо рН среды доводить до 7.

      Выращивание в емкостях на качалке. Емкость стерилизуют при 1 атм в течение часа, заполняют средой на 1/5 часть объема, повторно стерилизуют при 0,5 атм 30 минут. В остывшую среду вносят инокулят в пламени горелки или в факеле. Культуру выращивают пять суток на качалке при 26±3⁰С.

      К концу культивации в среде образуется до 10⁶ покоящихся спор/мл, которые являются основным действующим началом препарата. [1]

                               Высушивание, фасовка, упаковка.

     Субстрат со зрелой массой гриба высыпают в пластиковые или эмалированные кюветы слоем не более 3 см и проводят сушку при 30…35⁰С, хорошей вентиляции и периодическим перемешиванием. Влажность готового препарата не должна превышать 8%.

     Готовый препарат затаривают в мешки из крафт-бумаги. Каждый мешок маркируют с указанием номера партии, вида субстрата, даты изготовления препарата, титра, срока и условий хранения. Так же необходимо приложить инструкцию по применению пириформина [5] 

              2.6. Контроль качества и стандартизация пириформина

     Для определения количества жизнеспособных спор в готовом препарате используется два метода: прямой подсчет в камере Горяева и метод высева на твердую питательную среду в чашках Петри. 

                             Определение титра в камере Горяева.

    От каждой партии препарата отбирают 3-5 проб из разных мест по всей глубине и составляют общую пробу массой 70-100 г. Общую пробу тщательно перемешивают, после чего отвешивают навеску 10г с точностью 0,01г и переносят в колбу со 100 мл стерильной воды и стерильным крупнозернистым песком. Колбу закрывают стерильной пробкой и взбалтывают ее содержимое в течение 5 минут. Разведение препарата в приготовленной взвеси составляет 1:10 Параллельно готовят 7-9 пробирок, в каждую из которых добавляют по 9 мл дистиллированной воды, закрывают ватными пробками и стерилизуют. Затем готовят серию последовательных разведений. Для этого из колбы чистой пипеткой берут 1 мл суспензии и переносят в первую пробирку с 9 мл воды, получают разведение 1:100. Суспензию этого разведения тщательно перемешивают с помощью новой (чистой) пипетки, затем берут 1 мл полученного разведения и переносят его во 2 пробирку (разведение в 1000 раз). Для каждого нового разведения необходимо использовать отдельную стерильную пипетку

      Камеру Горяева с хорошо притертым стеклом заполняют суспензией соответствующего разведения. Количество спор подсчитывают в 5 больших квадратах камеры (или в 20-100 малых квадратах), определяют среднее количество клеток в 1 малом квадрате и рассчитывают по формуле

       Х=N×4×10⁶,

Где Х  – титр исследуемой суспензии  клеток/1 мл

     N – среднее количество клеток в одном малом квадрате

Для определения  титра исходного препарата необходимо титр исследуемой суспензии умножить на соответствующее разведение.

 

           Определение титра методом посева на питательную среду

      Готовят серию последовательных разведений как указанно в предыдущем методе. Из трех последних разведений, предварительно тщательно перемешанных, производят посев в чашки Петри на агаризованную среду Чапека или сусло-агар из расчета 1 мл суспензии на чашку. Этот объем распределяют по поверхности среды шпателем. Из одного разведения делают не менее 5 параллельных высевов. Для параллельных высевов из одного разведения можно пользоваться одной стерильной пипеткой и одним шпателем. Засеянные чашки помещают в термостат с температурой 23-25⁰С. Первый учет роста гриба проводят через 4-5 дней после посева, а затем через каждые 2-3 дня отмечают вновь появившиеся колонии антагониста. Титр препарата вычисляют по формуле:

Т=А+К

Где  Т – титр препарата, спор/1г

       А – среднее число колоний,  выросших при высеве из данного  разведения (среднее арифметическое  из 5 чаш Петри)

       К – разведение, из которого  произведен высев. 

При использовании  чашечного метода все операции необходимо проводить в стерильном боксе  [5]. 

                                    2.7. Техника безопасности

      При производстве пириформина следует соблюдать общие правила безопасности в микробиологических лабораториях

• При изготовлении суспензий необходимо пользоваться пипеткой с резиновой грушей
• При взятии навески или проб работу необходимо проводить в вытяжном шкафу
• Не допускать попадание живой культуры на кожу рук
• После окончания работы вымыть руки теплой водой с мылом

    Кроме этого к работе допускаются лица прошедшие предварительный медицинский осмотр, инструктаж по технике безопасности и получившие письменное разрешение на право работы с биологическими агентами. Персонал должен быть обеспечен и систематически пользоваться спецодеждой:респиратором типа РУ-60 МА или ШБ-1 «лепесток», резиновыми перчатками, резиновым фартуком.

    Во время обработок запрещено пить, курить, принимать пищу. [1,4,5] 

                        2.8. Технико-экономический расчет

                                                                                                          Таблица 1

     Перечень оборудования и материалов для получения пириформина

 Нормы расхода ректификованного для стерилизации бокса и оборудования.

1. Обработка рук и инструментов – 10мл на 1 раз
2. Горение спиртовки 1ч – 130мл
3. Разовая обработка бокса и емкости – 50м

                        3. Проект биолаборатории

     Для производства пириформина необходима биолаборатория. Производственная биолаборатория – специфическое и сложное хозяйство, в составе которого имеются здания или помещения, различное оборудование. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

1. Рабочая комната  – холодильник для хранения культур
2. Автоклавная – в данном помещении располагается автоклав для стерилизации среды.
4. Бокс с предбоксником – качалка кругового вращения.

5. Термостатная. Термостат для культивации гриба.

6. Комната  для сушки биомассы – в данной  комнате расположен термошкаф.

7. Моечная  – мойка со столом.

8. Комната  для размола биомассы – мельница  для размола.

9. Комната  для контроля качества.

10. Склад  для хранения препарата. 

 

    
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

                                            Заключение

      Биологические препараты играют ключевую роль в биологической защите от вредителей, болезней. Их использование относится и к оперативным и к фундаментальным способам воздействия на вредные организмы в агроэкосистемах. Как правило, применение биопрепаратов запускает механизмы экологически безопасной защиты растений. Воздействуя только на целевые мишени, биопрепараты обеспечивают активное участие других естественных регуляторов численности в подавлении фитофагов, фитопатогенов или сорных растений. Поэтому актуальной становится тема разработки новых биологических препаратов [5].