Приготовление кистологических препратов

      -  забор материала должен проводиться  как можно раньше после смерти  или забоя животного, а при  возможности живого объекта (биопсия), чтобы лучше сохранились структуры  клетки, ткани или органа;

      -    забор кусочков должен производиться  острым инструментом, чтобы не  травмировать ткани;

      -   толщина кусочков не должна  превышать 5 мм, чтобы фиксирующий  раствор мог проникнуть в толщу  кусочка;

      - обязательно производится маркировка  кусочка (указывается наименование  органа, номер животного или фамилия  человека, дата забора и так  далее. 

     2.Фиксация материала. Сразу после окончания фиксации производится промывка материала или водой (после водных фиксаторов), или 80%-ным спиртом (после спиртовых фиксаторов). Количество смен промывных жидкостей – не менее 3. Время – до 24 часов. Фиксация обеспечивает предотвращение процессов разложения, что способствует сохранению целостности структур. Это достигается тем, что взятый из органа маленький образец либо погружают в фиксатор (спирт, формалин, растворы солей тяжелых металлов, осмиевая кислота, специальные фиксирующие смеси), либо подвергают термической обработке. Под действием фиксатора в тканях и органах происходят сложные физико-химические изменения. Наиболее существенным из них является процесс необратимой коагуляции белков, вследствие которого жизнедеятельность прекращается, а структуры становятся мертвыми, фиксированными. Фиксация приводит к уплотнению и уменьшению объема кусочков, а также к улучшению последующей окраски клеток и тканей.

     3. Обезвоживание в спиртах возрастающей концентрации. Параллельно происходит уплотнение материала. Последовательное перемещение материала через ряд растворов называется проводка. После водных фиксаторов используется 8 смен спирта: 20%, 40%, 80%, две смены по 96%, две смены по 100%. После спиртовых фиксаторов – 4 смены спирта : две смены по 96% и две смены по 100%. В каждой смене материал выдерживается по 1 часу.

      4. Просветление. Это пропитывание материала растворителем парафина – ксилолом (бензолом, хлороформом). Образец помещается на 1 час последовательно в каждый из последующих растворов: 3 части спирта + 1 часть ксилола, затем 2 части спирта + 2 части ксилола, затем 1 часть спирта + 3 части ксилола, затем две смены ксилола.

      5. Заливка в парафин. Это замещение ксилола парафином. Образец помещают в смесь ксилола и парафина при температуре 55...57 градусов и оставляют в термостате при этой температуре до полного испарения ксилола (от нескольких часов до нескольких суток). Затем при температуре 55...57 градусов производится проводка через парафин I (6...12 часов), парафин II (6...12 часов) и заливка в парафин III. Парафины I, II, III отличаются только чистотой: парафин III – это окончательная среда, которая должна обладать наибольшей чистотой. В итоге получаются парафиновые блоки, в которых заключены образцы материала. Эти блоки можно резать в любом направлении.

      6. Приготовление срезов на специальных приборах (микротоме или ультрамикротоме) с помощью специальных ножей. Срезы для световой микроскопии приклеиваются на предметные стекла, а для электронной микроскопии – монтируется на специальные сеточки.

      7. Окрашивание срезов. Парафиновые срезы наклеивают на чистое предметное стекло. В качестве клея можно использовать смесь белка куриного яйца с глицерином (в соотношении 1 : 2) с добавлением антисептика (тимола или фенола). Обычно производят депарафинирование срезов. Для этого стекла с наклеенными срезами проводят через ксилол, спирты убывающей концентрации (100%, 96%, 80%, 70%) и дистиллированную воду. Время нахождения в каждой среде – 2...3 минуты. Далее окрашивают согласно методикам. Окрашивание срезов (в световой микроскопии) или напыление их солями металлов (в электронной микроскопии) применяют для увеличения контрастности изображения отдельных структур при рассматривании их в микроскопе. Методы окраски гистологических структур очень разнообразны и выбираются в зависимости от задач исследования.

  Гистологические красители (по химической природе) подразделяют на кислые, основные и нейтральные. В качестве примера можно привести наиболее употребительный краситель гематоксилин, который окрашивает ядра клеток в фиолетовый цвет, и кислый краситель — эозин, окрашивающий цитоплазму в розово-желтый цвет. Избирательное сродство структур к определенным красителям обусловлено их химическим составом и физическими свойствами. Структуры, хорошо окрашивающиеся кислыми красителями, называются оксифильными, а окрашивающиеся основными —базофильными. Например, цитоплазма клеток чаще всего окрашивается оксифильно, а ядра клеток – окрашиваются базофильно.

  Структуры, воспринимающие как кислые, так и  основные красители, являются нейтрофильными (гетерофильными). Окрашенные препараты обычно обезвоживают в спиртах возрастающей крепости и просветляют в ксилоле, бензоле, толуоле или некоторых маслах. Для длительного сохранения обезвоженный гистологический срез заключают между предметным и покровным стеклами в канадский бальзам или другие вещества. Готовый гистологический препарат может быть использован для изучения под микроскопом в течение многих лет.

  Для электронной микроскопии срезы, полученные на ультрамикротоме, помещают на специальные сетки, контрастируют  солями урана, свинца и других металлов, после чего просматривают в микроскопе и фотографируют. Полученные микрофотографии  служат объектом изучения наряду с  гистологическими препаратами.

     8. Обезвоживание и просветление окрашенных срезов. Выполняется путем проводки через спирты возрастающей концентрации, а затем через ксилол.

      9. Заключение в среды (заливка). Для длительного хранения препаратов их необходимо заключить в среду, предохраняющую препарат от окисления воздухом и от поражения грибками. Для заливки используются специальные смолы (канадский бальзам, пихтовый бальзам), которые растворяют в ксилоле до консистенции жидкого меда. Каплю такого раствора наносят на срез и покрывают покровным стеклом.

      Для ускоренного приготовления препаратов обезвоживание окрашенных срезов не производят, а для заливки используют глицерин–желатину. Для приготовления  этой среды 15 г чистого (белого) желатина растворяют в 100 мл дистиллированной воды при нагревании, добавляют  100 г глицерина и 2 капли фенола.

      В ряде случаев для приготовления  срезов используются замораживающие микротомы. Замораживающей жидкостью служит жидкая углекислота. На замораживающем микротоме  можно резать фиксированный и  нефиксированный материал. Достоинство  замораживающих микротомов в том, что  не требуется длительной проводки образцов через различные среды. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

      2.Приготовление  препаратов для  электронной микроскопии

      Для целей электронной микроскопии  в этапах приготовления препаратов имеются некоторые особенности, но общие принципы те же. Главное  отличие заключается в том, что  гистологический препарат для световой микроскопии может длительно  храниться и многократно использоваться. Срезы для электронной микроскопии  используются однократно. При этом вначале интересующие объекты препарата  фотографируются, а изучение структур производится уже на электроннограммах.

      Из  тканей жидкой консистенции (кровь, костный  мозг и другие) изготавливаются препараты в виде мазка на предметном стекле, которые также фиксируются, окрашиваются, а затем изучаются.

      Из  ломких паренхиматозных органов (печень, почки и другие) изготавливаются  препараты в виде отпечатка органа: после разлома или разрыва  органа, к месту разлома органа прикладывается предметное стекло, на которое приклеиваются некоторые  свободные клетки. Затем препарат фиксируется, окрашивается и изучается.

      И наконец, из некоторых органов (брыжейка, мягкая мозговая оболочка) или из рыхлой волокнистой соединительной ткани  изготавливаются пленочные препараты  путем растягивания или раздавливания  между двумя стеклами, также с  последующей фиксацией, окраской, заливкой в смолы и дальнейшем изучении. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

3.Изготовление препаратов для трансмиссионной микроскопии

      Для фиксации материала обычно используют осмиевую кислоту. Для заливки обезвоженного  препарата используют различные  смолы (а не парафин). Для изготовления сверхтонких срезов (толщиной 20...100 нм) используется ультрамикротом с  алмазными или стеклянными ножами. Вместо окрашивания органическими  красителями используется импрегнация  образца солями свинца, урана, осмия. Часто вместо импрегнации производят напыление поверхности образца  тяжелыми металлами.

      Для изучения мембран используются более  сложные методики приготовления  препаратов. Например, вначале образец  ткани замораживается при температуре  менее 100^О. Затем образец раскалывается острым ножом. При этом часто трещина проходит параллельно плоскости мембраны. В результате обнажаются ранее скрытые структуры, например, интегральные белки.

      Затем создается реплика скола. Вначале  в вакууме производится возгонка льда. На поверхность скола наносится  слой углерода, а на эту реплику  из углерода напыляется тяжелый металл. Биологические структуры растворяются в сильной кислоте. Получившаяся поверхность является точной копий  биологической структурой.

      Электроны, прошедшие через образец, фокусируются и направляются на флуоресцентный экран, на котором и формируется видимое  изображение. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Содержание

Введение

1.Изготовление  препарата для световой микроскопии

      1.1 Временные препараты

      1.2 Постоянные препараты

2.Приготовление  препаратов для электронной микроскопии

3.Изготовление  препаратов для трансмиссионной  микроскопии

Список  литературы 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Список  литературы

1. http://www.morphology.dp.ua – Гистология. mp3 – Введение, методы исследования в гистологии.
2. Мяделец О.Д. – Гистология, цитология и эмбриология человека. Часть II. Частная гистология. Витебск. 2001.