Особенности процесса биологического окисления (дыхания) микроорганизмов

     a-кетоглутаровая кислота подвергается далее окислительному декарбоксилированию, катализируемому a-кетоглутаратдегидрогеназным комплексом, в результате чего образуется сукцинил-КоА.

Рис. 1. Цикл трикарбоновых кислот и глиоксилатный шунт:

Ф₁ — цитратсинтаза (конденсирующий фермент); Ф₂ — аконитаза;

Ф₃ — изоцитратдегидрогеназа; Ф₄ — a-кетоглутаратдегидрогеназа;

 Ф₅ — сукцинилтиокиназа; Ф₆ — сукцинатдегидрогеназа; Ф₇ — фумараза; Ф₈ — малатдегидрогеназа; Ф₉ — изоцитратлиаза; Ф₁₀ — малатсинтетаза. Включение углеродных атомов ацетильного остатка в молекулу лимонной кислоты помечено звездочками. Пунктирными линиями изображены реакции глиоксилатного шунта

Эта реакция — единственная необратимая реакция из десяти, составляющих ЦТК. Один из продуктов реакции — сукцинил-КоА — представляет собой соединение, содержащее высокоэнергетическую тиоэфирную связь.

     Следующий этап — образование янтарной кислоты  из сукцинил-КоА, катализируемое сукцинилтиокиназой, в результате которого энергия, освобождающаяся при разрыве тиоэфирной связи, запасается в фосфатной связи ГТФ. ГТФ затем отдает свою фосфатную группу молекуле АДФ, что приводит к образованию АТФ. Следовательно, на данном этапе ЦТК имеет место субстратное фосфорилирование.

     Янтарная  кислота окисляется в фумаровую  с помощью фермента сукцинатдегидрогеназы. Далее фумаровая кислота гид-ратируется под действием фумаразы, в результате чего возникает яблочная кислота, которая  подвергается дегидрированию, приводящему к образованию ЩУК. Реакция катализируется НАД-зависимой малатдегидрогеназой. Этой реакцией завершается ЦТК, так как вновь регенерируется молекула-акцептор (ЩУК), запускающая следующий оборот цикла. Однако поскольку из цикла происходит постоянный отток для биосинтезов промежуточных метаболитов, приводящий к понижению уровня ЩУК, возникает необходимость в ее дополнительном синтезе. Это обеспечивается как в реакциях карбоксилирования пирувата или фосфоенолпирувата, так и с помощью последовательности из двух реакций, получивших название глиоксилатного шунта (рис. 1). В первой из них изолимонная кислота под действием изоцитратлиазы расщепляется на янтарную и глиоксиловую кислоты. Во второй реакции, катализируемой малатсинтетазой, глиоксиловая кислота конденсируется с ацетил-КоА с образованием яблочной кислоты, превращающейся далее в ЩУК. В результате двух новых реакций происходит синтез C₄-кислоты из двух C₂-остатков. Глиоксилатный шунт не работает при выращивании на субстратах, катаболизирование которых приводит к образованию пировиног-радной кислоты. Он включается при выращивании организмов на C₂-соединениях.

     Энергетическим "топливом", перерабатываемым в  ЦТК, служат не только углеводы, но и  жирные кислоты (после предварительной  деградации до ацетил-КоА), а также многие аминокислоты (после удаления аминогруппы в реакциях дезамини-рования или переаминирования). В результате одного оборота цикла происходят 2 декарбоксилирования, 4 дегидрирования и 1 фосфорилирование. Итогом 2 декарбоксилирований является выведение из цикла 2 атомов углерода (2 молекулы CO₂), т. е. ровно столько, сколько его поступило в виде ацетильной группы. В результате 4 дегидрировании образуются 3 молекулы НАД-H₂ и 1 молекула ФАД-H₂. Как можно видеть, в процессе описанных выше превращений весь водород оказывается на определенных переносчиках и задача теперь — передать его через другие переносчики на молекулярный кислород.

      3. ДЫХАТЕЛЬНАЯ ЦЕПЬ 

     Электроны с восстановленных переносчиков (НАД-H₂, НАДФ-H₂, ФАД-H₂), образующихся при функционировании ЦТК или окислительного пентозофосфатного цикла, поступают в дыхательную цепь, где проходят через ряд этапов, опускаясь постепенно на все более низкие энергетические уровни, и акцептируются соединением, служащим конечным акцептором электронов. Перенос электронов приводит к значительному изменению свободной энергии в системе. В наиболее совершенном виде и единообразии дыхательная цепь предстает у эукариот, где она локализована во внутренней мембране митохондрий. У эубактерий дыхательные цепи поражают разнообразием своей конкретной организации при сохранении принципиального сходства в строении и функционировании.

     Дыхательные электронтранспортные цепи состоят  из большого числа локализованных в  мембране переносчиков, с помощью  которых электроны передаются или вместе с протонами, т. е. в виде атомов водорода, или без них. Компонентами цепи, локализованными в мембране, являются переносчики белковой (флавопротеины, FeS-белки, цитохромы) или небелковой (хиноны) природы. Флавопротеины и хиноны осуществляют перенос атомов водорода, а FeS-белки и цитохромы — электронов.

     НАД(Ф)-зависимые  дегидрогеназы, катализирующие отрыв  водорода от молекул различных субстратов и передающие его на стартовый  переносчик дыхательной цепи — НАД(Ф)-H₂-дегидрогеназу, — растворимые ферменты. Дегидрогеназы флавопротеиновой природы, выполняющие аналогичную функцию, могут быть локализованными в мембране (например, сукцинатдегидрогеназа) или существовать в растворимой форме (ацетил-КоА-дегидрогеназы жирных кислот). Водород с них поступает в дыхательную цепь на уровне хинонов.

     Известно  более 250 НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ, активно участвующих в реакциях промежуточного обмена. Но не все из них имеют отношение к энергетическому  метаболизму. С помощью дегидрогеназ осуществляется перенос гидрид-иона (2e^– + Н⁺ ® H^–) от субстрата к НАД(Ф), при этом в среду переходит протон (рис. 93, А). Атом водорода входит в состав пиридинового кольца, а электрон присоединяется к азоту пиридинового кольца. После восстановления НАД(Ф)-H₂ отщепляется от активного центра фермента и переносится к мембране, где акцептируется флавиновой дегидрогеназой и передает ей восстановительные эквиваленты. Одновременно к дегидрогеназе, освобожденной от кофермента, присоединяется окисленная молекула НАД(Ф), поступающая из среды. Таким образом, особенность НАД(Ф) — их подвижность, позволяющая им курсировать от молекул — доноров электронов, находящихся в цитоплазме, к акцепторам электронов, локализованным в мембране.

     В состав флавиновых дегидрогеназ входят флавиновые нуклеотиды, прочно связанные с апоферментом и не отщепляющиеся от него ни на одной стадии каталитического цикла. Окислительно-восстановительные свойства флавопротеинов обусловлены способностью изоаллоксазинового кольца рибофлавина к обратимому переходу из окисленного состояния в восстановленное, при котором происходит присоединение к кольцу 2 электронов в составе атомов водорода (рис. 2, Б). При изучении дыхательных цепей особенно интересны два связанных с мембраной флавопротеина: сукцинатдегидрогеназа, катализирующая окисление сукцината в ЦТК, и НАД(Ф)-H₂-дегидрогеназа, катализирующая восстановление своей флавиновой простетической группы, сопряженное с окислением НАД(Ф)xH₂.

     Рис. 2. Механизмы обратимого окисления и восстановления некоторых переносчиков водорода: А — пиридиновое кольцо НАД(Ф);

     Б — изоаллоксазиновое кольцо рибофлавина  ФМН или ФАД;

     В — хиноидное кольцо. Присоединенные атомы водорода и электрон пиридинового кольца обведены пунктиром (по Dagley, Nicholson, 1973) 

     Участие в дыхательном  электронном транспорте принимают  белки, содержащие железосероцентры.

     Хиноны  — жирорастворимые соединения, имеющие  длинный терпеноидный "хвост", связанный с хиноидным ядром, способным к обратимому окислению — восстановлению путем присоединения 2 атомов водорода (рис. 2,В). Наиболее распространен убихинон, функционирующий в дыхательной цепи на участке между флавопротеинами и цитохромами. В отличие от остальных электронных переносчиков хиноны не связаны со специфическими белками. Небольшой фонд убихинона растворен в липидной фазе мембран.

     Цитохромы, принимающие участие на заключительном этапе цепи переноса электронов, представляют собой группу белков, содержащих железопорфириновые простетические группы (гемы). С помощью цитохромов осуществляется перенос электронов, в процессе которого меняется валентность железа:

     Fe²⁺ « Fe³⁺ + e^–

     В митохондриях обнаружено пять цитохромов (b, c, c₁, a, a₃), различающихся между собой спектрами поглощения и окислительно-восстановительными потенциалами. Различия по этим параметрам обусловлены белковыми компонентами цитохромов, природой боковых цепей их порфиринов и способом присоединения гема к белкам. Конечные цитохромы (a + a₃) передают электроны на молекулярный кислород, представляя собой собственно цитохромоксидазу, в реакционном центре которой содержатся помимо двух гемов два атома меди. Образование воды имеет место при переносе на молекулу кислорода 4 электронов. Некоторые цитохромоксидазы осуществляют перенос на O₂ только 2 электронов, следствием чего является возникновение перекиси водорода. Перекись водорода далее разрушается каталазой или пероксидазой.

     Рис. 3. Схема переноса электронов в дыхательной цепи митохондрий:

     ФМН — простетическая группа НАД(Ф)-H₂ — дегидрогеназы;

     ФАД — простетическая группа сукцинатдегидрогеназы; УХ — убихинон;

       b, c, с1, а, a₃ — цитохромы.

     Сплошными линиями обозначены процессы, протекающие  в мембране; прерывистыми — в  цитозоле клетки; зигзагообразной линией показаны места действия ингибиторов 

     Таким образом, дыхательная  цепь переноса электронов в митохондриях состоит из большого числа промежуточных переносчиков, осуществляющих электронный транспорт с органических субстратов на O₂. Последовательность их расположения, представленная на рис. 3, подтверждается различного рода данными: значениями окислительно-восстановительных потенциалов переносчиков, ингибиторным анализом.

     Обнаружены  ингибиторы, специфически действующие  на определенные участки дыхательной  цепи. Амитал и ротенон блокируют  перенос электронов на участке до цитохрома b, действуя предположительно на НАД(Ф)-H₂-дегидрогеназу. Антимицин А (антибиотик, продуцируемый Streptomyces) подавляет перенос электронов от цитохрома b к цитохрому c₁. Цианид, окись углерода и азид блокируют конечный этап переноса электронов от цитохромов a + a₃ на молекулярный кислород, ингибируя цитохромоксидазу. Если блокировать перенос электронов в электронтранспортной цепи определенными ингибиторами, то переносчики, находящиеся на участке от субстрата до места действия ингибитора, будут в восстановленной, а переносчики за местом действия ингибитора — в окисленной форме.

     Рис. 4. Дыхательные цепи Azotobacter vinelandii (A).

     Micrococcus lysodeikticus (Б) и Escherichia coli (В) в аэробных (1), микроаэробных (2) и анаэробных (3) условиях: ФП — флавопротеин;

     FeS — железосероцентр; УХ — убихинон; MX — менахинон;

       ФР — фумаратредуктаза; b, c, c₁, a, a₃ — цитохромы 

     4. ЗАПАСАНИЕ КЛЕТОЧНОЙ ЭНЕРГИИ В ПРОЦЕССЕ ДЫХАНИЯ  

     Вся система переноса электронов от субстрата  на O₂ через длинную цепь переносчиков представлялась бы нерационально громоздкой, если бы единственной целью процесса было соединение электронов с молекулярным кислородом. Другое назначение этого механизма состоит в запасании освобождающейся в процессе электронного переноса энергии путем трансформирования ее в химическую энергию фосфатных связей.

     Имеющиеся экспериментальные данные подтверждают выдвинутый в начале 60-х гг. английским биохимиком П. Митчеллом хемиосмотический механизм энергетического сопряжения электронного транспорта с фосфорилированием. П. Митчелл "обратил внимание" на судьбу протонов при электронном транспорте, которые переносятся в этом процессе через мембрану в одном направлении, создавая градиент концентрации H⁺ по обе стороны мембраны. Перенос электронов и протонов обеспечивается определенным сорасположением мембранных переносчиков, а также свойствами самой мембраны, в первую очередь ее непроницаемостью для протонов.

     В митохондриях на 3 участках окислительной  цепи происходит выделение протонов во внешнюю среду. Соответственно 3 реакции ведут к образованию Dm_H⁺ (рис. 5). Первая локализована в начале дыхательной цепи и связана с функционированием НАД(Ф)-H₂-дегидрогеназы. Второй генератор Dm_H⁺ определяется способностью убихинона переносить водород. Последний локализован в конце дыхательной цепи и связан с активностью цитохромоксидазы.

     Поскольку синтез молекулы АТФ связан, как  минимум, с переносом 2 протонов через  АТФ-синтазу, а при окислении НАД(Ф)-H₂ молекулярным кислородом, т. е. поступлении 2 электронов на 1/2O₂ выделяются 6H⁺, максимальный выход АТФ в этом .процессе составляет 3 молекулы. Для количественной оценки эффективности фосфорилирования при переносе электронов используют отношение P/O, означающее количество потребленных молекул неорганического фосфата, приходящихся на 1 поглощенный атом кислорода. H₂ препаратах изолированных митохондрий показано, что при переносе водорода от изолимонной или яблочной кислот на НАД⁺, а затем на молекуляроный кислород отношение P/O равно 3. Приокислении янтарной кислоты, водород которой переносится на сукцинатдегидрогеназу и далее на убихинон, возможны только 2 фосфорилирования, так как при этом выпадает участок дыхательной цепи, где локализован первый генератор Dm_H⁺. Таким образом, место включения электронов от разных субстратов в цепь их дальнейшего транспорта определяет число функционирующих протонных помп в дыхательной цепи.