Молекулярно-генетические методы исследования. Выделение ДНК. ПЦР

СРС  
«Молекулярно-генетические методы исследования. Выделение ДНК. ПЦР»

 

Государственный Медицинский Университет г. Семей

 

Выполнила: Скрипникова К.М.

Проверила: Ордабаева И. Н.

 

2017 год

План:

 

• Введение
• Метод флуоресцентной гибридизации «FISH- метод» 
• Метод исследования генетических маркеров
• Полимеразная цепная реакция
• Заключение
• Список литературы

Введение:

 

• Молекулярно-генетические методы — большая и разнообразная группа методов, предназначенная для выявления вариаций (повреждений) в структуре участка ДНК (аллеля, гена, региона хромосомы) вплоть до расшифровки первичной последовательности оснований. В основе этих методов лежат генно-инженерные манипуляции с ДНК и РНК. Исходным этапом всех молекулярно-генетических методов является получение образцов ДНК. 

Гибридизация in situ

 

«рождение» молекулярной цитогенетики:

 

1980-е

 

•

 

 

 

 

•

 

Мечение с  помощью  радиоизотопов

 

 

Мечение с  помощью  флуоресцентных  красителей –  Fluorescence In  Situ Hybridization  (FISH)

FISH: «+» и «-»

 

«±» Таргетный анализ: зависит от специфичности используемого  ДНК-зонда

 

 

«+» Разрешающая способность - 100-300 Kв

• Возможность определения микрохромосомных перестроек  (делеций, дупликаций, инверсий, инсерций)

 

«+» Более объективный метод анализа

 

«+» Относительно легкий, быстрый и хорошо воспроизводимый  метод

 

«+» Возможность проведения анализа на культурах клеток с  низкой митотической активностью, фиксированных  клетках и тканях (interphase FISH)

Области применения FISH

 

Преимплантационная  генетическая

 

Постнатальная  диагностика

 

диагностика

• Преимплантационный  генетический скрининг  (определение  анеуплоидий хромосом  13,15,16,17, 18,21,22,X,Y)

 

• Преимплантационная  генетическая  диагностика  (исследование  дериватных хромосом у  носителей хромосомных  перестроек)

 

Пренатальная  диагностика

• Скрининг основных  анеуплоидий  некультивированных  клеток амниотической  жидкости

 

• Уточнение/верификац  ия результатов  стандартного  цитогенетического  исследования

 

• Уточнение/верификация  результатов стандартного  цитогенетического  исследования
• Исследование сложных  перестроек ‐ тройных и  более сложных  транслокаций, инсерций

• Определение степени  мозаицизма

• Исследование природы  маркерных хромосом
• Исследование  хромосомных перестроек  в онкогематологии

• Диагностика солидных  опухолей

• Скрининг анеуплоидий

сперматозоидов

ДНК-пробы

 

• LSI – локус-специфичные пробы

(locus specific identifiers)

 

 

• CEP – центромероспецифичные пробы

(chromosome enumeration probes)

 

 

• WCP- цельнохромосомные пробы

(whole chromosome painting probes)

 

 

• SubTel – субтеломерные пробы (хромосомоспецифичные)

(subtelomere probes)

 

• Telp/Telq – теломероспецифичные пробы

(telomere probes)

Варианты FISH

 

Metaphase FISH

 

Interphase FISH

 

Multi-color FISH

 

MCB-FISH

LSI – локус-специфичные пробы

 

(locus specific identifiers)

 

- Специфичны к строго определенным последовательностям  ДНК

 

Используются в

диагностике:

 

• Анеуплоидий
• Делеций
• Дуликаций
• Инверсий
• Транслокаций

•

 

Уточнение точек разрыва  при хромосомных  перестройках

 

Микроделеционных  синдромов

CEP – центромероспецифичные пробы

(chromosome enumeration probes)

 

- Специфичны к центромерным и прицентромерным повторам

ДНК

 

Используются в  диагностике:

 

• Быстрый скрининг  анеуплоидий

• Транслокаций

• Определение  природы цетромеры  маркерных хромосом

 

Скрининг анеуплоидий  хромосом сперматозоидов

 

47, XXY

WCP- цельнохромосомные пробы

 

(whole chromosome painting probes)

Специфичны в отношении всей  хромосомы - окрашивание p- и  q-плечей

Используются в  диагностике:

• Исследование хромосомных  перестроек - транслокаций,  инсерций

• Верификация, уточнение  результатов  кариотипирования

• Определение природы  маркерных хромосом,  дополнительного  хромосомного материала

Multi-color FISH

 

(спектральное  кариотипирование - SKY)

 

Одновременный анализ всех 24 хромосом

Используются в диагностике:

• Изучение сложных  межхромосомных перестроек –  тройных и более сложных  транслокаций, инсерций

• Определние природы  маркерных хромосом

 

2n

 

- 1

Multicolor banding – MCB FISH

 

Изучение  внутрихромосомных  перестроек:

• Инверсий
• Инсерций
• Делеций
• Дупликаций

 

 

Уточнение точек  разрывов при  межхромосомных  перестройках

Молекулярные маркеры –генетические маркеры, анализируемые на уровне ДНК

 

Р1 Р2

F2  3:1

 

Аллели маркерных локусов - различные формы (нуклеотидные  последовательности, отличающиеся по длине и/или по нуклеотидным  заменам) одного и того же маркера, расположенные в одинаковых участках  (локусах) гомологичных хромосом.

 

В случае, если метод анализа маркера позволяет выявлять оба аллеля, говорят  о кодоминантном наследовании, если выявляется только один аллель – о  доминантном наследовании.

 

аллели кодоминантный маркер

 

Р1 Р2

F2

1:2:1

 

 

доминантный маркер

 ПЦР-маркеры

 

 Микросателлиты

или

SSR (simple sequences repeats) –  простые повторяющиеся последо-  вательности (Tautz and Renz, 1984)

 

RAPD

(random amplified polymorphic DNA) –  случайно амплифицированная  полиморфная ДНК (Welsh et al., 1990;  Williams et al., 1990)

 

выделение ДНК

 

ПЦР со  случайными

праймерами  (10-11 п.н.)

 

ПЦР со  специфическими

праймерами, подобранными к  областям, фланкирующим

микросателлит (ок. 20 п.н.)

1

 

2

 

3

 

1

 

3

 

1

 

2

 

3

 

1

 

2

 

3

 

Электро-  форетическое  разделение  продуктов ПЦР в  агарозном геле

 

Электро-  форетическое  разделение

 

продуктов ПЦР в 2

денатурирующем

 

ПААГ

 

монолокусные

 

мультилокусные

молекулярные маркеры

 

RAPD

 

мультилокусные

 

  DArT…

Филогенетические исследования  Картирование генов геномов (AFLP, DArT)  Молекулярная паспортизация сортов/пород  Исследование генетического разнообразия

 

CAPS (dCAPS)

 

(cleaved amplified polymorphic sequences) –

 

последовательности (Konieczny and Ausubel, 1993)

 

ISSR

(inter simple sequence repeats) –  межмикросателлитные последовательности  (Zietkiewicz et al., 1994).

 

монолокусные

RFLP

 Микросателлиты

STS

 

(sequences tagged site) – последовательности,  характеризующие локус. (Olson et al., 1989).

SCAR

(sequence characterized amplified region) –  последовательность, характеризующая амплифи-  цированную область (Paran and Michelmore, 1993).

 

 SNP…

Картирование генов, хромосом и геномов  Маркирование генов

Селекция с помощью молекулярных маркеров  Молекулярная паспортизация сортов/пород  Диагностика заболеваний

Исследование генетического разнообразия  Филогенетические исследования

 

SSCP

(single strand conformation polimorphism) –  полиморфизм конформации одноцепочечной ДНК.  (Orita et al., 1989).

 

(

 

IRAP

inter-retrotransposon amplified polimorphism) –  полиморфизм амплифицированных после-  довательностей между ретротранспозонами  (Kalendar and Schulman, 2006).

AFLP

(amplified fragment length polymorphism) –  полиморфизм длины амплифицированных  фрагментов (Vos et al., 1995).

SSAP

 

(sequence-specific amplification polymorphism) –расщепленные амплифицированные полиморфные

 

полиморфизм специфично-  амплифицированных последовательностей  (Waugh et al., 1997).

 мультилокусные маркеры на основе блот-гибридизации

Заключение:

 

• К настоящему времени достигнуты серьезные успехи во всех основных разделах молекулярной медицины - диагностике, профилактике и лечении наследственных и мультифакторных заболеваний. Нет сомнения, что уже в недалеком будущем будет положительно решена и проблема создания индивидуальных, семейных и специализированных баз ДНК-данных - различных вариантов генетических паспортов.

Литература

 

R.J. McKinlay Gardner, Grant R. Sutherland and Lisa G. Shaffer (2012).Chromosome  abnormalities and genetic counseling.4th ed.  Oxford University Press, New York.

 

С. Г. Ворсанова, Ю. Б. Юров  В. Н. Чернышов  Медицинская цитогенетика  Медпрактика-М, 2006

 

 

Баранов В.С., Кузнецова Т. В. Цитогенетика эмбрионального  развития человека: Научно-  практические аспекты . — СПб:  Издательство Н-Л,2006. — 640 с..

2006