Методы генной инженерии

Автор работы: Пользователь скрыл имя, 21 Мая 2015 в 20:29, реферат

Описание работы

Современный экспериментатор нередко располагает лишь ничтожными количествами исходных препаратов индивидуального белка или ДНК. Например, в случае биопсии ткани человека или редкого штамма бактерии, плохо поддающейся выращиванию в объеме.
Между тем физические методы исследования требуют, хотя и на порядок величины меньшего количества биологического материала, чем два десятилетия назад, но, все-таки, зачастую во много раз большего, чем имеется в наличии

Файлы: 1 файл

Методы генной инженерии.docx

— 240.48 Кб (Скачать файл)

3.2.2.Разработка  ДНК-вакцин

Используемые сегодня вакцины можно разделить в зависимости от методов их получения на следующие типы:

• живые аттенуированные вакцины;

• инактивированные вакцины;

• вакцины, содержащие очищенные компоненты микроорганизмов (протеины или полисахариды);  
• рекомбинантные вакцины, содержащие компоненты микроорганизмов, полученные методом генной инженерии.

Технологию рекомбинантной ДНК применяют также для создания живых ослабленных вакцин нового типа, достигая аттенуации путем направленных мутаций генов, кодирующих вирулентные протеины возбудителя заболевания. Эту же технологию используют и для получения живых рекомбинантных вакцин, встраивая гены, кодирующие иммуногенные протеины, в живые непатогенные вирусы или бактерии (векторы), которые и вводят человеку.

 
Рис. 5. Одноразовый генный пистолет компании «Powderject»  
а — внешний вид; б — в разрезе



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

В 1990 г. в некоторых исследовательских лабораториях приступили к разработке новых вакцин, которые основаны на введении «голой» молекулы ДНК. Уже в 1992–1993 гг. несколько независимых групп исследователей в результате эксперимента доказали, что введение чужеродной ДНК в организм животного способствует формированию иммунитета.

Принцип применения ДНК-вакцин заключается в том, что в организм пациента вводят молекулу ДНК, содержащую гены, кодирующие иммуногенные белки патогенного микроорганизма. ДНК-вакцины называют еще генными, генетическими, полинуклеотидными вакцинами, вакцинами из нуклеиновых кислот. На совещании специалистов по генным вакцинам, проведенном в 1994 г. под эгидой ВОЗ, было решено отдать предпочтение термину «вакцины из нуклеиновых кислот» с их подразделением соответственно на ДНК- и РНК-вакцины. Такое решение основывалось на том, что употребление термина «ДНК-вакцина» не сформирует ошибочное мнение о том, что новые вакцины вносят изменения в генетические структуры организма вакцинируемого человека. Тем не менее, многие специалисты считают более точным термин «генные вакцины» (поскольку иммунная реакция направлена не против ДНК, а против антигенного белка, кодируемого геном), который также часто применяют.

Для получения ДНК-вакцин ген, кодирующий продукцию иммуногенного протеина какого-либо микроорганизма, встраивают в бактериальную плазмиду. Плазмида представляет собой небольшую стабильную молекулу кольцевой двухцепочечной ДНК, которая способна к репликации (воспроизведению) в бактериальной клетке. Кроме гена, кодирующего вакцинирующий протеин, в плазмиду встраивают генетические элементы, которые необходимы для экспрессии («включения») этого гена в клетках эукариотов, в том числе человека, для обеспечения синтеза белка. Такую плазмиду вводят в культуру бактериальных клеток, чтобы получить большое количество копий. Затем плазмидную ДНК выделяют из бактерий, очищают от других молекул ДНК и примесей. Очищенная молекула ДНК и служит вакциной. Введение ДНК-вакцины обеспечивает синтез чужеродных протеинов клетками вакцинируемого организма, что приводит к последующей выработке иммунитета против соответствующего возбудителя. При этом плазмиды, содержащие соответствующий ген, не встраиваются в ДНК хромосом человека.

ДНК-вакцины можно вводить в солевом растворе обычным парентеральным способом (внутримышечно, внутрикожно). При этом бoльшая часть ДНК поступает в межклеточное пространство и только после этого включается в клетки. Применяют и другой метод введения, используя так называемый генный пистолет (рис. 5, 6). Для этого ДНК фиксируют на микроскопических золотых гранулах (около 1–2 мкм), затем с помощью устройства, приводимого в действие сжатым гелием, гранулы «выстреливают» непосредственно внутрь клеток. Следует отметить, что аналогичный принцип введения лекарства с помощью струи сжатого гелия используют и для разработки новых способов доставки лекарственных средств (с этой целью оптимизируют размеры частиц лекарственного вещества и их плотность для достижения необходимой глубины проникновения в соответствующую ткань организма). Этот метод требует очень небольшого количества ДНК для иммунизации. Если при иммунизации классическими субъединичными вакцинами вводят микрограммы протеина, то при использовании ДНК-вакцины — нанограммы и даже меньше. Говоря о минимальном количестве ДНК, достаточном для индукции иммунного ответа, С.А. Джонстон, директор Центра биомедицинских изобретений Техасского университета, в журнале «The Scientist» (1998) отмечает, что с помощью генного пистолета можно однократно ввести мыши «фактически 27 тыс. различных плазмид и получить иммунный ответ на индивидуальную плазмиду».

Рис. 6. Многоразовый генный пистолет компании «Powderject»  
а — сменный картридж; б — прибор в полной сборке



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Последующие эксперименты подтвердили способность ДНК-вакцин формировать иммунитет в отношении разнообразных возбудителей.

Потенциальные преимущества ДНК-вакцин

ДНК-вакцины обладают рядом преимуществ по сравнению с традиционными вакцинами.

3.2.3. Повышение  эффективности и безопасности иммунизации

1. Способствуют выработке  антител к нативной молекуле  вирусных протеинов.

Если в качестве вакцины использовать иммуногенные протеины, то в процессе их производственного получения и очистки могут произойти изменения трехмерной конфигурации этих молекул. Поэтому иммунизация может быть низкоэффективной в связи с образованием антител, специфичных к измененным иммуногенным молекулам, но не к нативным вирусным протеинам. Введение ДНК-вакцин, как правило (см. «возможные ограничения в применении ДНК-вакцин»), приводит к синтезу клетками вирусных антигенов в их нативной форме.

2. Способствуют выработке  цитотоксических Т-лимфоцитов.

Инактивированные или субъединичные вакцины в основном индуцируют гуморальный иммунный ответ. Это обусловлено тем, что характер механизмов представления и распознавания антигенов клетками иммунной системы зависит от того, синтезируется ли антиген в клетке или поступает в нее извне. А от этого в свою очередь зависит характер активации и взаимодействия клеток, участвующих в иммунном ответе. Поскольку ДНК-вакцины обеспечивают синтез иммунногенных белков клетками самого организма, они способствуют формированию как гуморального, так и клеточного иммунитета. Активация цитотоксических Т-клеток без введения живого патогена является важнейшей отличительной чертой ДНК-вакцин.

3. Могут избирательно  воздействовать на различные  субпопуляции Т-лимфоцитов.

В принципе возможна разработка ДНК-вакцин, которые избирательно активируют разные типы хелперных Т-лимфоцитов. Благодаря этому могут быть созданы генные вакцины для лечения лиц с аутоиммунными или аллергическими заболеваниями, патогенез которых связан с нарушением различных звеньев иммунной регуляции.

4. Способствуют формированию  длительного иммунитета.

Как и живые аттенуированные, ДНК-вакцины способны обеспечивать иммунитет в течение длительного времени. Этим они отличаются от инактивированных вакцин, которые обеспечивают длительный иммунитет только путем проведения повторных вакцинаций.

5. Устраняют риск инфицирования.

По своему действию ДНК-вакцины напоминают живые аттенуированные вирусные вакцины или некоторые рекомбинантные вакцины на основе живых вирусных векторов, так как иммуногенные белки синтезируются в организме самого человека. Но при введении генных вакцин отсутствует опасность инфицирования человека.

3.2.4. Упрощение  разработки и производства новых вакцин

1. Простота получения  большого количества ДНК-патогенных  микроорганизмов.

Многие микроорганизмы сложно культивировать (вирусы гепатита В и С, папилломы человека и др.), что затрудняет создание вакцин. Благодаря современным технологиям (например, применение полимеразной цепной реакции) можно получить достаточное количество ДНК практически любого патогенного микроорганизма, выделить гены, кодирующие иммуногенные протеины, и создать вакцину. Выполнение Проекта человеческого генома приведет к тому, что через несколько лет ученые будут располагать расшифрованными геномами большинства известных патогенных микроорганизмов. Это значительно облегчит задачу скрининга генов для идентификации тех из них, которые кодируют молекулы иммуногенных протеинов возбудителя заболевания. В тех случаях, когда такие гены трудно выявить, разработчики вакцин могут воспользоваться «библиотеками ДНК» соответствующих патогенов (коллекциями последовательностей комплементарной ДНК, содержащими только те участки ДНК какого-либо микроорганизма, которые кодируют продукцию белков, то есть все экспрессированные гены). Эти молекулы ДНК легко клонировать и использовать в исследованиях по созданию вакцин.

2. Возможность создания комбинированных вакцин.

В качестве комбинированных вакцин сейчас широко применяют только инактивированные вакцины, поскольку при введении нескольких аттенуированных вирусных вакцин они могут терять иммуногенность (так называемый феномен вирусной интерференции). ДНК-вакцины можно комбинировать. Это особенно важно, так как в настоящее время детям с 1-й недели жизни и до 16–18 лет выполняют не менее 18 вакцинаций. Мультивалентные ДНК-вакцины можно использовать для выработки эффективного иммунитета против паразитарных заболеваний (так как антигенные характеристики паразита могут зависеть от стадии его развития в организме человека), а также для борьбы с лекарственно-устойчивыми формами микроорганизмов.

3. Упрощение производства вакцин.

Технологии производства большинства применяемых сегодня вакцин чрезвычайно разнообразны и во многом зависят от особенностей возбудителя заболевания, против которого разработана вакцина. Напротив, технология получения различных ДНК-вакцин существенно не отличается. ДНК-вакцины отличаются только генами, которые включены в плазмиду. Генные вакцины можно отнести к субъединичным вакцинам, поскольку они приводят к синтезу одного или нескольких иммуногенных белков в организме человека. Однако методы создания «классических» субъединичных вакцин, как и рекомбинантных субъединичных вакцин на основе применения вирусных векторов, значительно сложнее. Использование единой технологии может существенно упростить стандартизацию методов производства ДНК-вакцин и контроля их качества. Кроме того, это позволит сократить затраты на их производство.

3.2.5. Упрощение  требований к условиям хранения

1. Высокая стабильность вакцин.

ДНК-вакцины высокостабильны. Они способны выдерживать низкие и высокие температуры (немногим ниже температуры кипения воды) и разные условия влажности. Поэтому генные вакцины не требуют создания так называемых холодовых цепочек (необходимость хранения вакцин в холодильных установках на всем пути от места производства до конечного потребителя). Это качество дает им значительные преимущества перед другими вакцинами, так как в некоторых развивающихся странах на поддержание холодовых цепочек приходится около 80% стоимости проведения одной вакцинации. Таким образом, стоимость транспортировки и хранения ДНК-вакцин будет значительно ниже.

Возможные ограничения в применении ДНК-вакцин

Поскольку гены кодируют синтез белковых молекул, то ДНК-вакцины способствуют формированию иммунитета только в отношении протеиновых компонентов болезнетворных микроорганизмов. Поэтому они не могут заменить вакцины, действие которых основано на использовании других антигенных молекул, например капсулярных антигенов, представленных полисахаридами (полисахаридные пневмококковые, менингококковые, брюшнотифозные вакцины и др.).

Другое ограничение связано с тем, что молекулы белков после синтеза часто претерпевают в клетке дальнейшие биохимические изменения, например подвергаются гликозилированию. Эти процессы в клетках человека, животных и микроорганизмов могут протекать по-разному. Поэтому существует вероятность того, что структура антигенного протеина, синтезированного в клетках человека, будет отличаться от структуры натурального иммуногенного вирусного протеина. Результаты проведенных экспериментов пока не подтвердили этих опасений.

Кроме того, недостаточно хорошо изучены особенности перорального или интраназального применения ДНК-вакцин. Между тем, слизистые оболочки являются воротами инфекции для многих возбудителей заболеваний и известно, что для ряда патогенных микроорганизмов наиболее эффективным методом иммунизации является инициация иммунного ответа в месте инфицирования.

3.2.6. Вопросы безопасности  применения

Существуют опасения, что молекула ДНК-плазмиды может встраиваться в ДНК хромосом человека, что приведет к мутации гена на этом участке. Однако эксперименты на мышах свидетельствуют, что интеграция плазмиды в ДНК мышей наблюдается приблизительно в 1000 раз реже, чем спонтанные мутации генов.

Известно также, что иммунологическая толерантность (неспособность к иммунному ответу на антиген) может быть вызвана повторным введением очень низких доз антигена. При иммунизации посредством ДНК иммуногенный протеин также синтезируется в организме в небольшом количестве в течение продолжительного времени. Эта проблема требует более тщательного изучения, но, по-видимому, не является существенным препятствием в связи с возможностью регулирования количества вводимой ДНК и соответственно числа клеток, синтезирующих антигенный белок.

Высказывалось предположение, что введение ДНК-вакцин может приводить к развитию аутоиммунных заболеваний в результате иммунной реакции, направленной против клеток организма человека, экспрессирующих антигенный протеин, или вследствие образования антител к чужеродной ДНК. Однако проведенные эксперименты позволяют надеяться, что введение ДНК-вакцин не повышает риск развития аутоиммунных реакций, во всяком случае по сравнению с применяемыми в настоящее время аттенуированными вирусными вакцинами.

3.2.7. Участие фармацевтических  компаний в разработке ДНК-вакцин

Осознание перспективности применения генных вакцин способствовало значительному увеличению финансирования исследований в этом направлении не только со стороны государственных организаций, но и частных компаний.

Кроме быстро развивающихся биотехнологических компаний («Genentech», «Powderject», «Quiagen», «Cobequid», «Vaxin», «Vical Inc.»), к разработке ДНК-вакцин проявляют большой интерес и крупнейшие транснациональные фармацевтические компании («Aventis», «Glaxo Wellcome», «Merck», «Pfizer» и др.), которые проводят не только самостоятельные исследования в этой области, но и заключают соглашения с биотехнологическими компаниями или с академическими институтами о совместной разработке генных вакцин. Характерным примером может служить небольшая американская биотехнологическая фирма «Vical Inc.», которая одной из первых приступила к разработке ДНК-вакцин. Побудительным фактом для работы в этом направлении послужили результаты одного эксперимента, проведенного в лаборатории «Vical Inc.» в 1989 г., когда исследователи случайно установили, что введение «голой» вирусной ДНК мышам приводит к продукции большого количества вирусных белков. После этого фирма запатентовала метод прямого введения «голой» ДНК в клетки. Уже в 1991 г. «Vical Inc.» заключила соглашение с компанией «Merck & Co.» о совместной разработке ДНК-вакцин для предупреждения инфекционных заболеваний. Через 2 года в журнале «Science» были опубликованы результаты этих совместных исследований, подтверждающие эффективность применения ДНК-вакцины против гриппа у мышей. Вскоре компания «Merck & Co.» заключила ряд других соглашений с «Vical Inc.» относительно совместной разработки, производства или продажи терапевтических и/или профилактических ДНК-вакцин против ВИЧ/СПИДа, туберкулеза, гепатита В, гепатита С, герпеса и заболеваний, вызываемых вирусами папилломы человека. Аналогичные соглашения фирма «Vical Inc.» заключила с другим крупнейшим производителем вакцин — компанией «Aventis Pasteur» — о разработке ДНК-вакцин, предупреждающих инфицирование цитомегаловирусом, возбудителем малярии, H. pylori, респираторно-синцитиальным вирусом, вирусом ветряной оспы и др. «Vical Inc.» сотрудничает также с компанией «Aventis Pharma» (ранее «Rhone Poulenc Rorer Pharmaceuticals, Inc.»), «Pfizer Inc.» (разработка ДНК-вакцин для применения в ветеринарии) и др. Компания «Vical Inc.» проводит также клинические исследования (I или II фаза) терапевтических вакцин и методов генной терапии (на основе технологии «голой» ДНК) для лечения больных с некоторыми злокачественными новообразованиями.

Информация о работе Методы генной инженерии