Лекарственные препараты, получаемые биотехнологическими методами. Ферменты

    Помимо  генетического фактора, огромное влияние  на продукцию ферментов оказывают  состав среды и условия культивирования  микроорганизмов. При этом не только наличие индуктора в среде способно увеличить выход фермента. Чрезвычайно важным является качественный и количественный состав питательных сред. Например, большинство видов плесневых грибов рода Aspergillus хорошо растут на достаточно простой синтетической среде Чапека с сахарозой и нитратом. Для синтеза амилазы, однако, сахарозу следует заменить крахмалом и увеличить концентрацию углерода и азота в среде. После этого активность фермента возрастает в 3 раза. Добавление аминокислот в виде экстракта солодовых ростков выход фермента повышает дополнительно в 4–5 раз. Оптимизируя состав питательной среды, можно повысить активность амилазы более чем в 500 раз. При подборе состава среды учитывают все факторы: вид и концентрацию источника углерода и энергии, факторы роста, минеральные элементы, индуцирующие субстраты. В качестве источников углерода и азота чаще всего применяют различное природное органическое сырье: крахмал, кукурузный экстракт, соевую муку, гидролизаты дрожжевых биомасс. Помимо источника углерода, азота и факторов роста, большое влияние на синтез ферментов оказывают минеральные соли магния, марганца, кальция, железа, цинка, меди и др., многие из которых входят в состав ферментов.

    Биотехнологическое  производство ферментов реализуется  двумя способами – поверхностным  и глубинным. Твердофазная поверхностная ферментация заключается в выращивании продуцента на поверхности тонкого слоя твердой сыпучей среды. Глубинная ферментация в жидкой среде может быть реализована как в условиях периодического процесса, так и с применением проточных систем. [1] 
 
 
 
 
 
 
 

    3  Промышленные названия препаратов ферментов

      Препараты ферментов, вырабатываемые промышленностью, кроме основного фермента (комплекса ферментов) содержат различные балластные вещества. Название ферментных препаратов складывается из сокращенного названия основного фермента и видового названия микроорганизма-продуцента. Например, препарат, содержащий в своей основе амилолитические ферменты и полученный при помощи культуры Aspergillus oryzae, называется амилоризин. В названии препарата указывается также способ культивирования и степень концентрирования и очистки: 

Амил ори зин    Г      10Х

       I         II     III   IV        V 

    I – название основного фермента; II – название микроорганизма-продуцента; III – окончание; IV – способ культивирования:

    "П"  – поверхностный, "Г" – глубинный; V – степень очистки (концентрирования):

    "Х"  – поверхностная культура или  культуральная жидкость;

    "2Х"  – концентрированные растворы  ферментов, освобожденные от биомассы;

    "3Х" – высушенные препараты "2Х";

    "10Х"  – осажденные органическими растворителями  и солями;

    "15Х"  –"30Х" – очищенные от  балластных веществ и других  ферментов с использованием различных  методов очистки и фракционирования. [2] 
 
 
 
 
 

    4 Твердофазная поверхностная ферментация

    Основные  параметры процесса приведены в  таблице 2 [3]:

    Таблица 2.  Основные параметры  твёрдофазной поверхностной  ферментации

 

При поверхностном  методе культура растет на поверхности твердой увлажненной питательной среды. Мицелий полностью обволакивает и довольно прочно скрепляет твердые частицы субстрата, из которого получают питательные вещества. Поскольку для дыхания клетки используют кислород, то среда должна быть рыхлой, а слой культуры-продуцента небольшим.

Выращивание производственной культуры происходит обычно в асептических условиях, но среду и кюветы необходимо простерилизовать. Перед каждой новой загрузкой  также необходима стерилизация оборудования.

Преимущества  поверхностной культуры: значительно более высокая конечная концентрация фермента на единицу массу среды (при осахаривании крахмала 5 кг поверхностной культуры заменяют 100 кг культуральной жидкости), поверхностная культура относительно легко высушивается, легко переводится в товарную форму.

Посевной  материал может быть трёх видов:

- культура, выросшая на твердой питательной  среде; 

- споровый  материал;

- мицелиальная  культура, выращенная глубинным  способом.

В три  этапа получают и посевную культуру. Сначала музейную культуру продуцента пересевают на 1 - 1.5 г увлажненных стерильных пшеничных отрубей в пробирку и выращивают в термостате до обильного спорообразования. Второй этап - аналогично, но в колбах, третий - в сосудах с 500 г среды. [14]

Основу  питательной среды составляют пшеничные отруби, как источник необходимых питательных и ростовых веществ. Кроме того, они создают необходимую структуру среды. Для повышения активности ферментов к отрубям можно добавлять свекловичный жом, соевый шрот, крахмал, растительные отходы. Стерилизуют среду острым паром при помешивании (температура - 105-140 С, время 60-90 минут). После этого среду засевают и раскладывают ровным слоем в стерильных кюветах. Кюветы помещают в растильные камеры. Культивируют в течение 36-48 часов.

Рост  делится на три периода, примерно равных по времени. Сначала происходит набухание конидий и их прорастание (температура не ниже 28о С), затем  рост мицелия в виде пушка серовато-белого цвета (необходимо выводить выделяемое тепло) и образование конидий. Для создания благоприятных условий роста и развития продуцента необходима аэрация и поддержание оптимальной влажности (55-70%).

Выросшая  в неподвижном слое при поверхностном  культивировании культура представляет корж из набухших частиц среды, плотно связанных сросшимся мицелием. Массу  размельчают до гранул 5-5 мм. Культуру высушивают до 10-12% влажности при  температурах не выше 40оС, не долее 30 минут. Иногда препарат применяют прямо в неочищенном виде - в кожевенной и спиртовой промышленности. В пищевой и особенно медицинской промышленности используются ферменты только высокой степени очистки.

Схема очистки сводится к следующему:

• освобождение от нерастворимых веществ;
• освобождение от сопутствующих растворимых веществ;
• фракционирование (как правило, хроматографическими методами).

Для выделения  фермента из поверхностной культуры необходима экстракция. Как правило, экстраген - вода. При этом в раствор переходят сахара, продукты гидролиза пектиновых веществ и целлюлозы. Стадию выделения и очистки завершает сушка. После сушки препарат должен содержать не более 6-8% влаги, тогда он может в герметичной упаковке храниться до года без потери активности.

Стандартизация  ферментного препарата - доводка  активности фермента до стандартной, соответствующей  требованиям ГОСТ. Для этого используются различные нейтральные наполнители - крахмал, лактоза и др.

Учитывая  огромные перспективы применения ферментных препаратов в различных отраслях промышленности и сельского хозяйства, медицине, можно сделать заключение о необходимости расширения исследований в этой области для оптимизации технологии и гарантийного получения высокоактивных и стабильных препаратов микробных ферментов. [10] 

      Технологическая  схема поверхностной ферментации представлена на схеме: 

 
 

5 Метод глубинной фементации

Таблица 3 Условия проведения глубинной ферментации 

 
 

      В этом случае микроорганизмы выращиваются в жидкой питательной среде. Технически более совершенен, чем поверхностный, так как легко поддается автоматизации и механизации. Концентрация фермента в среде при глубинном культивировании обычно значительно ниже, чем в водных экстрактах поверхностной культуры. Это вызывает необходимость предварительного концентрирования фильтрата перед его выделением.

      При глубинном культивировании продуцентов  ферментов выделяют, как и в  любом биотехнологическом процессе, 5 этапов.

      Некоторые предварительно измельчают, отваривают или гидролитически расщепляют. Готовые к растворению компоненты подают при постоянном помешивании в емкость для приготовления среды в определенной последовательности. Стерилизацию среды проводят либо путем микрофильтрации с помощью полупроницаемых мембран, либо при помощи высоких температур. Время обработки в этом случае зависит как от интенсивности фактора, так и от уровня обсемененности объекта. Стерилизуются также все коммуникации и аппараты. Воздух очищается до и после аэрирования. До - потому что содержит частицы пыли органической и неорганической природы, после - так как несет клетки продуцента.[13]

      Для засева питательной среды материал готовят также глубинным методом. Вид его зависит от продуцента: для грибов это мицелиальная вегетативная масса, для бактерий - молодая растущая культура на начальной стадии спорообразования. Получение посевного материала состоит в увеличении массы продуцента в 3-4 стадии. Объем посевного материала зависит от физиологических особенностей продуцента. Если продуцент размножается только вегетативно, он резко возрастает (до 5-20%). Если же происходит обильное спороношение - сокращается до 1%.

      Биосинтез ферментов в глубинной культуре протекает в течение 2-4 суток при  непрерывной подаче воздуха и  перемешивании. Высокая концентрация питательных веществ на первых этапах могут тормозить рост биомассы продуцента, поэтому часто свежая среда или некоторые её компоненты вводятся в ферментер на стадии активного роста. Температурный оптимум находится в интервале 22-32оС. В современных технологических процессах ведется непрерывное автоматическое определение содержания в среде углеводов, количества образовавшихся метаболитов и концентрации клеток. Данные поступают в компьютер, который определяет стратегию коррекции процесса и автоматически регулирует его. Этим достигается максимальная производительность и наилучшее качество продуктов.