Культура растительной ткани

Приготовление питательных сред для культивирования клеток и тканей in vitro.

Компоненты среды для выращивания растительных клеток и тканей можно разделить на 6 основных групп, что обычно отражает порядок приготовления концентрированных маточных растворов: макроэлементы, микроэлементы, источники железа, витамины, источники углерода, фитогормоны.

Основой для всех питательных сред для культивирования растительных эксплантов является смесь минеральных солей. Это соединения азота в виде нитратов, нитритов, солей аммония; фосфора – в виде фосфатов; серы – в виде сульфатов; а также растворимых солей К+, Na+, Са2+, Мg2+. Железо используется в виде хелатов [FeО4 или Fe2O4 + ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или её натриевая соль Na ЭДТА (трилон Б)] – наиболее доступной форме для усвоения растительными тканями.

Азот, фосфор, сера входят в состав органических соединений: белков, жиров, нуклеиновых кислот. Железо, цинк, марганец, молибден, кобальт в сочетании с порфиринами образуют макромолекулы пигментов фотосинтеза (хлорофилла), окислительно-восстановительных ферментов (каталазы, пероксидазы, полифенолоксидазы). Следовательно, все эти соединения выполняют в клетках и тканях структурную функцию. В то же время ионы К+, Na+, Са2+, Cl –, Н + необходимы для регуляции pH среды и поддержания физиологических градиентов клеток (тургора, осмотического давления, полярности).

В качестве источника углерода для биологических макромолекул, а также при культивировании гетеротрофных тканей (каллусов и суспензий) в питательные среды добавляют углеводы в концентрации 20-60 г/л. Обычно это дисахариды (сахароза), моносахариды (гексозы: глюкоза и фруктоза, пентозы: ксилоза и другие). Полисахариды в питательных средах практически не используются. Только некоторые типы тканей (опухолевые), содержащие гидролитические ферменты, выращивают на средах с крахмалом, раффинозой (природный трисахарид), целлобиозой.

Для стимуляции биохимических реакций в клетке используют биологические катализаторы – витамины группы В: В1, В6, В12; С (аскорбиновую кислоту), РР (никотиновую кислоту), мезоинозит (витаминоподобное соединение).

Тиамин (В1) входит в состав пируватдекарбоксилазы, участвует в превращениях углеводов. Тиаминпирофосфат входит в состав ферментов окислительного декарбоксилирования кетокислот (пировиноградной и кетоглутаровой), является коферментом транскетолазы (фермент пентозомонофосфатного пути).

Пиридоксин (В6) в виде фосфорнокислого эфира входит в состав ферментов декарбоксилирования и переаминирования аминокислот.

Никотиновая кислота (РР) в виде амида входит в состав дегидрогеназ НАД и НАДФ, катализирующих донорно-акцепторную электротранспортную цепь Н+ (отнятие Н+ от молекул органических веществ).

Для управления процессами формообразования в культуре тканей необходимы биологические регуляторы роста и развития – фитогормоны. Эти вещества влияют на дифференциацию и дедифференциацию клеток и тканей, инициируют гистогенез, индуцируют деление и растяжение клеток, участвуют в процессах старения и созревания, либо стимулируют, либо ингибируют рост и развитие клеточных культур, обуславливают формирование пола. В биотехнологических исследованиях чаще используют гормоны, стимулирующие рост и развитие: ауксины, цитокинины, гиббереллины.

Ауксины: ИУК – b-индолил-3-уксусная кислота, ИМК – индолил-3-мас-ляная кислота, НУК – a-нафтилуксусная кислота, 2,4-Д – 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота.

Цитокинины: кинетин – 6-фурфуриламинопурин, зеатин, NN-дифенил-мочевина, 6-БАП – 6-бензиламинопурин.

Гиббереллины: гиберрелловая кислота.

В качестве биологических добавок для индукции первичного каллуса можно использовать растительные экстракты (10-15 % от общего объёма среды): кокосовое молоко (жидкий эндосперм кокосового ореха), вытяжки из незрелых зерновок кукурузы (лучше в период молочной спелости), которые содержат цитокинины – кинетин и зеатин (6-ти замещенные аминопурины) и NN-дифенилмочевину.

В культуре in vitro применяют жидкие и агаризованные (твердые) среды. Жидкие среды используются для культивирования суспензий, каллусов, изолированных органов и тканей, растений - регенерантов. При этом для поддержания эксплантов в пробирки со средой помещают специальные мостики - поддержки из фильтровальной бумаги или синтетических пористых материалов.

Агаризованные среды готовят на основе агар-агара – полисахарида, входящего в состав морских водорослей, который образует с водой гель при pH 5,6-6,0. иногда в качестве уплотнителя и заменителя агар-агара используют полиакриламидные гели (биогели) P10 и P200.

Для искусственных питательных сред растворы макро- и микросолей готовят заранее и используют многократно. Это маточные (концентрированные) растворы. Их хранят в специальных условиях: макро- и микросоли в холодильнике в сосудах с притертыми пробками при 0…+4оС; витамины, фитогормоны, ферменты, растительные экстракты – при -20оС в небольших по 5-10 мл сосудах с пробками (пеницилловые флаконы).

Маточные растворы макросолей обычно превосходят рабочие по концентрации в 10-40 раз, микросолей – в 100-1000 раз, витаминов – в 1000 раз.

Растворы фитогормонов желательно готовить непосредственно перед работой со средами.

Для приготовления маточного раствора макро- и микросолей каждую соль растворяют в отдельном стаканчике при нагревании, затем сливают и доводят до нужного объема. В охлажденную смесь микросолей последним добавляют раствор солей молибдена, а в макросоли – раствор солей магния (для предотвращения выпадения осадка).

Маточные растворы хлористого кальция и хелата железа (сернокислое железо + ЭДТА, либо Na ЭДТА – трилон Б) готовят и хранят отдельно от других солей.

Концентрированные растворы витаминов готовят следующим образом: 10-кратные навески растворяют в 10 мл дистиллированной воды каждый отдельно.

Фитогормоны – это вещества, которые плохо растворяются в воде. Поэтому предварительно 100 мг вещества растворяют в небольших количествах (0,5-2,0 мл) спирта (ауксины, гиббереллины), 0,5-1н HCl или КОН (цитокинины), затем подогревают до полного растворения (кроме абсцизовой кислоты и кинетина) и доводят до 100 мл объема (1 мл содержит 1 мг вещества).

В таблице представлен состав наиболее часто используемых питательных сред. Как правило, начиная работать с новым объектом, исследователи модифицируют состав стандартных сред, особенно часто варьируя концентрации и набор органических компонентов.

 

 

Частные примеры питательных сред.

 

Приготовление маточных растворов для среды Мурасиге-Скуга.

№ п.п.	Компонент среды	Количество вещества
	Маточный раствор макросолей (г на 1 л маточного раствора)
1. 2. 3. 4.	KNO3 NH4NО3 KH2PO4 MgSO4 . 7H2O или MgSO4 безводный	38 33 3,4 7,4 3,6
5.	CaCl2 . 2H2O или CaCl2 безводный	8,8 6,65
	Маточный раствор микросолей (мг на 100 мл маточного раствора)
6. 7. 8. 9. 10. 11. 12.	Na2MoO4 . 2H2O CuSO4 . 5H2O H3BO3 MnSO4 . 5H2O или MnSO4 . 4H2O ZnSO4 . 7H2O KJ CoCl2 . 6H2O	25 2,5 620 2410 2230 860 83 2,5
13.	FeSO4 Na2 ЭДТА	557 745

Среда Мурасиге-Скуга (М-С) для клеточных и тканевых культур

Компоненты питательной среды
Маточный раствор макросолей Маточный раствор микросолей Fe-хеллат CaCl2 Тиамин-HCl Пиридоксин-HCl Никотиновая кислота Мезоинозит Глицин Сахароза	50 мл/л 1 мл/л 5 мл/л 50 мл/л 0,1 мг/л 0,5 мг/л 0,5 мг/л 100 мг/л 2 мг/л 30 г/л
рН 5,6-5,8

 

Модифицированная питательная среда Мурасиге-Скуга для культивирования апикальных меристем картофеля

Компоненты питательной среды
Маточный раствор макросолей Маточный раствор микросолей Fe-хеллат CaCl2 Тиамин-HCl Пиридоксин-HCl Витамин В12 Никотиновая кислота Фолиевая кислота Мезоинозит Гидролизат казеина Аденин Пантотенат Са Рибофлавин Биотин Активированный уголь ГК Кинетин Сахароза Глюкоза Агар-агар	50 мл/л 1 мл/л 5 мл/л 50 мл/л 1 мг/л 1 мг/л 0,015 мг/л 2 мг/л 0,5 мг/л 100 мг/л 1 г/л 40 мг/л 10 мг/л 0,5 мг/л 1 мг/л 10 г/л 2 мг/л 0,5 мг/л 20 г/л 20 г/л 7 г/л
рН 5,7-5,8

 

Модифицированная питательная среда Мурасиге-Скуга для микроразмножения картофеля черенкованием побегов

Компоненты питательной среды
Маточный раствор макросолей Маточный раствор микросолей Fe-хеллат CaCl2 Тиамин-HCl Пиридоксин-HCl Никотиновая кислота Аденин Кинетин Гибберелловая кислота Пантотенат Са	50 мл/л 1 мл/л 5 мл/л 50 мл/л 1 мг/л 1 мг/л 2 мг/л 40 мг/л 0,5 мг/л 2 мг/л 10 мг/л
Активированный уголь Сахароза Агар-агар	10 г/л 30 г/л 7 г/л
рН 5,8

Приготовление маточных растворов для среды Гамборга-Эвелега.

№ п.п.	Компонент среды	Количество вещества
	Маточный раствор макросолей (г на 1 л маточного раствора)
1. 2. 3. 4.	KNO3 (NH4)2SO4 MgSO4 . 7H2O NaH2PO4 . H2O	60 2,68 10,0 3,0
5.	CaCl2 . 2H2O	3,0
	Маточный раствор микросолей (мг на 100 мл маточного раствора)
6. 7. 8. 9. 10. 11.	Na2MoO4 . 2H2O CuSO4 . 5H2O H3BO3 MnSO4 . H2O ZnSO4 . 7H2O CoCl2 . 6H2O	25 7,5 300 1000 200 2,5
12.	FeSO4 Na2 ЭДТА	557 745

 

Среда Гамборга-Эвелега

Компоненты питательной среды
Маточный раствор макросолей Маточный раствор микросолей Fe-хеллат CaCl2 Тиамин-HCl Пиридоксин-HCl Никотиновая кислота Мезоинозит 2,4-Д Сахароза	50 мл/л 1 мл/л 5 мл/л 50 мл/л 10 мг/л 1 мг/л 1 мг/л 100 мг/л 2 мг/л 20 г/л
рН 5,8

Модифицированная питательная среда Мурасиге-Скуга для клубнеобразования у картофеля.

Компоненты питательной среды
Маточный раствор макросолей Маточный раствор микросолей Fe-хеллат CaCl2 Тиамин-HCl Пиридоксин-HCl Никотиновая кислота Аскорбиновая кислота Кинетин Сахароза Агар-агар	50 мл/л 1 мл/л 5 мл/л 50 мл/л 1 мг/л 0,5 мг/л 0,5 мг/л 1 мг/л 0,5 мг/л 50 г/л 7 г/л
рН 5,8-6,0

Приготовление маточных растворов для среды Блейдза.

№ п.п.	Компонент среды	Количество вещества
	Маточный раствор макросолей (г на 1 л маточного раствора)
1. 2. 3. 4. 5.	KNO3 KCl KH2PO4 NH4NO3 MgSO4 . 7H2O или MgSO4 безводный	20 1,3 6 20 1,44 0,7
6.	Ca(NO3)2 . 4H2O	10,28
	Маточный раствор микросолей (мг на 100 мл маточного раствора)
7. 8. 9. 10.	H3BO3 MnSO4 . H2O или MnSO4 . 5H2O ZnSO4 . 7H2O KJ	160 440 627 150 80
11.	FeSO4 Na2 ЭДТА	557 745

Среда Блейдза для каллусогенеза.

Компоненты питательной среды
Маточный раствор макросолей Маточный раствор микросолей Fe-хеллат CaNO3 Тиамин-HCl Пиридоксин-HCl Никотиновая кислота Аскорбиновая кислота Мезоинозит 2,4-Д Сахароза Агар-агар	50 мл/л 1 мл/л 5 мл/л 50 мл/л 0,5 мг/л 0,5 мг/л 1 мг/л 1 мг/л 0,1 г/л 2 мг/л 20 г/л 7 г/л
рН 6,0

Среда Блейдза для соматического эбриогенеза.

Компоненты питательной среды
Маточный раствор макросолей Маточный раствор микросолей Fe-хеллат CaNO3 Тиамин-HCl Пиридоксин-HCl Никотиновая кислота Аскорбиновая кислота Мезоинозит ИУК Кинетин АБК Сахароза Агар-агар	50 мл/л 1 мл/л 2,5 мл/л 50 мл/л 0,5 мг/л 0,5 мг/л 1 мг/л 1 мг/л 0,1 г/л 0,2 мг/л 0,2 мг/л 0,05 мг/л 20 г/л 7 г/л
рН 6,0

Способы стерилизации в биотехнологии

Все работы с культурой клеток и тканей in vitro проводят в стерильных (асептических) условиях в стерильном боксе или ламинар-боксе, стерильными инструментами, в стерильной посуде, на стерильных питательных средах. В случае нарушения стерильности на средах хорошо развиваются микроорганизмы (грибы, бактерии), нарушающие состав среды и подавляющие рост растительных эксплантов.

Чаще всего для стерилизации помещений (боксов для пересадки тканей, культуральных комнат) используют ультрафиолетовое облучение в течение 0,5-2 часов (в зависимости от площади помещения). Работы в облученном помещении начинают через 15-20 минут после отключения бактерицидных ламп, так как под действием ультрафиолетового излучения двухатомный кислород воздуха становится трехатомным озоном – газом, токсичным для человека. Для достижения максимальной стерильности перед обработкой УФ все поверхности тщательно отмываются моющими средствами, водой и растворами хлорсодержащих веществ, поверхности ламинар-бокса обрабатывают 96 % спиртом.

Посуду, халаты, вату, бумагу, дистиллированную воду, питательные среды стерилизуют в автоклавах под давлением пара 1-2 атмосферы и температурой 120оС в течении 20-60 мин, в зависимости от объёма стерилизуемого материала.

Колбы, штативы со средой, вату, бумагу, халаты перед автоклавированием заворачивают в целлофановую бумагу, либо помещают в бюксы.

Металлические инструменты автоклавировать нельзя, так как под действием пара образуется ржавчина. Поэтому их стерилизуют сухим жаром в термостатах с температурой 170-250оС в течении 1-2 часов или на окрытом пламени горелки, что также не иене эффективно.