Хроматин и его специфическая регуляция экспрессии генов

     Перемещение нуклеосом факторами ремоделирования хроматина имеет ступенчатый характер. Большинство известных комплексов ремоделирования хроматина затрачивает одну молекулу АТФ для перемещения нуклеосомной глобулы на 10 п. н.(Рис.5)

Рис.5.Ремоделирование хроматина.На рисунке схематически изображен процесс ремоделирования. Сначала комплекс ремоделирования связывается с участками ДНК а и в (А); изменение конформации комплекса приводит к изгибанию ДНК, отрыву участка б и связыванию участка а (Б), после чего комплекс ремоделирования отсоединяется от участка в и возвращается в исходную конформацию, а волна деформации ДНК продвигается по октамеру гистонов (В). В итоге нуклеосома оказывается смещена на ДНК на расстояние а-б, при этом участок г переместился из нуклеосомной ДНК в линкерную, а участок а, напротив, связался октамером (Г).

2. Хроматин и регуляция транскрипции.

   В эукариотических клетках матрицей для РНК-полимераз служит ДНК, находящаяся в составе хроматина. Из общих соображений белки нуклеосом и более высокоорганизованного хроматина должны быть препятствием для образования инициационного комплекса и перемещения транскрипционного комплекса вдоль такой матрицы. Однако in vivo эти препятствия в соответствующих условиях легко преодолеваются. В последнее время, благодаря взаимно дополняющим друг друга биохимическим и генетическим данным, становятся более ясными основные механизмы, обеспечивающие этот повсеместно распространенный процесс.

2.1Активный и неактивный хроматин.

    Ученые давно обратили внимание на то, что ДНК в ядре упакована неоднородно. При окраске ядер красителями, специфически связывающимися с ДНК, можно видеть области, где ДНК упакована более компактно (иногда их еще называют хроматиновыми глыбками), и области, где локальная концентрация ДНК существенно ниже. Эти области получили названия гетерохроматина и эухроматина соответственно. Было весьма заманчивым связать различия в степени компактизации ДНК с ее транскрипционным статусом. Из общих соображений представлялось очевидным, что транскрипционно-активная ДНК должна быть упакована менее компактно. Первые экспериментальные подтверждения этой точки зрения были получены в опытах по обработке ядерной ДНК ДНКазой I. Оказалось, что активные гены расщепляются ДНКазой быстрее, чем неактивные. В дифференцированных клетках значительная часть генов не работает. Эти гены оказались относительно устойчивыми к ДНКазе I. При сравнении клеток, дифференцированных по разным путям, можно было видеть, что один и тот же ген предпочтительно расщепляется ДНКазой I в тех клетках, где он активен, и относительно устойчив к этому ферменту в клетках, где этот ген не транскрибируется. Феномен предпочтительной чувствительности к ДНКазе I активных генов принято называть общей ДНКазной чувствительностью. Его следует отличать от гиперчувствительности к ДНКазе I, о которой говорилось выше.

   Обнаружение предпочтительной  чувствительности транскрибирующейся фракции генома к ДНКазе I открыло принципиальную возможность выделения и характеристики коротких фрагментов транскрипционно-активного хроматина. Было продемонстрировано, что транскрипционно-активный хроматин характеризуется повышенным уровнем ацетилирования гистонов нуклеосомной частицы. Примерно в это же время в лаборатории Олфри был разработан метод выделения фрагментов транскрипционно-активного хроматина посредством афинной хроматографии на колонках с иммобилизованной ртутью. И в этом случае было показано, что транскрипционно-активный хроматин характеризуется повышенным уровнем ацетилирования гистонов. Другими отличительными признаками активного хроматина явились обедненность гистоном Н1 и некоторое обогащение различными типами HMG-белков. Еще одной характерной чертой нуклеосом активного хроматина является частое отсутствие одного из димеров Н2А-Н2В.  Характерной особенностью транскрипционно-активной фракции хроматина, является высокий уровень ацетилирования гистонов. В экспериментах по сборке хроматина in vitro продемонстрировано, что хроматин, собранный с использованием гиперацетилированных гистонов, обладает основными свойствами активного хроматина, в частности повышенной чувствительностью к нуклеазам.

2.2Транскрипция ДНК, организованной в нуклеосомы.

   Нуклеосомные частицы должны являться серьезным препятствием на пути транскрипции. Тем не менее четко продемонстрировано, что все РНК-полимеразы, в том числе и прокариотические, способны транскрибировать ДНК, организованную в нуклеосомы. Механизм транскрипции ДНК, организованной в нуклеосомы, остается предметом научных дискуссий. Существует две основные модели, объясняющие возможность транскрипции нуклеосомной нити. Одна из них предполагает, что нуклеосомная глобула, находящаяся на пути транскрипционного комплекса, временно удаляется, оставаясь при этом связанной с самим транскрипционным комплексом, и далее вновь связывается с ДНК за транскрипционным комплексом. Эта модель получила прямые подтверждения в модельных экспериментах по транскрипции бактериальными РНК-полимеразами организованного в нуклеосому фрагмента ДНК. Результаты этих экспериментов не удалось, однако, воспроизвести при использовании эукариотической РНК-полимеразы II. Другая модель транскрипции нуклеосомной нити предполагает, что дестабилизированные нуклеосомы активной фракции хроматина частично разворачиваются непосредственно в момент прохождения транскрипционного комплекса, в результате чего РНК-полимера за может считывать ДНК, не удаляя гистонов. Надо сказать, что в местах входа и выхода ДНК из нуклеосомы ДНК-белковые контакты относительно малочисленны, что допускает возможность постепенного разворачивания накрученной на нуклеосому петли ДНК. Работающий транскрипционный комплекс разворачивает двойную спираль ДНК, что компенсируется возникновением домена положительной суперспирализации перед транскрипционным комплексом. Витки ДНК на нуклеосоме представляют собой негативную суперспираль, стабилизированную взаимодействием с нуклеосомными гистонами. Понятно, что позитивная суперспирализация будет способствовать разворачиванию накрученных на нуклеосому петель ДНК.

В обеспечении возможности транскрипции организованной в нуклеосомы ДНК важную роль играют факторы ремоделирования хроматина.

    Сравнительно недавно  продемонстрировано, что важную  роль в транскрипции организованной  в нуклеосомы ДНК играет белковый  комплекс, получивший название FACT (facilitator of chromatin transcription). Этот белковый комплекс способствует временному удалению из нуклеосомы одного или обоих димеров Н2А-Н2В, облегчая разворачивание петель нуклеосомной ДНК в местах входа и выхода ДНК из нуклеосомной частицы. Для осуществления своей функции FACT должен быть посажен на активные промоторы. Это достигается при участии вспомогательного комплекса ремоделирования хроматина CHD1, который обладает сродством к FACT и к нуклеосомам, содержащим гистон НЗ, триметилированный по позиции К4.Эта модификация гистона НЗ характерна для активного хроматина. Нуклеосомы, содержащие НЗ, триметилированный по позиции К4, локализуются преимущественно в промоторных областях и в начале активных транскрипционных единиц. Для оптимальной работы FACT существенно еще и моноубиквитинилирование гистона Н2В по К120. Считается, что эта модификация способствует ди- и три- метилированию НЗ по позиции К4.

Исследования, проведенные с использованием метода иммунопреципитации хроматина, выявили неравномерное распределение модифицированных и вариантных форм гистонов в границах транскрипционных единиц . Это объясняется тем, что внесение некоторых модификаций прямо сопряжено с осуществлением транскрипции. В дрожжевых клетках этот процесс происходит следующим образом. Сразу после инициации транскрипции происходит фосфорилирование серинового остатка 5 (Ser5) в составе С-концевого домена (C-terminal domain, CTD) РНК-полимеразы II. Эта модификация способствует привлечению мультибелкового комплекса, известного как фактор элонгации PAF. Этот фактор способствует удержанию

в составе элонгирующего транскрипционного комплекса гис-тонубиквитинлигазы, которая убиквитинилирует гистон Н2В. Одновременно PAF привлекает в состав элонгирующего транскрипционного комплекса НЗК4 гистонметилазу (Set 1 комплекс COMPASS). Этот комплекс осуществляет ди- и триметилиро- вание НЗК4. Монометилирование осуществляется обычной гистонметилазой Set 1 и не зависит от убиквитинилирования гистона Н2В. По мере продвижения элонгирующего РНК-по- лимеразного комплекса вдоль транскрипционной единицы происходит дефосфорилирование Ser5 и фосфорилирование Ser2 в составе CTD. Следствием этого изменения в характере модификации CTD является освобождение гистонметилазы COMPASS и привлечение гистонметилазы Set2, которая осуществляет триметилироване лизинового остатка 36 гистона НЗ. Следствием этой сложной цепи процессов является накопление ди- и триметилированного по К4 гистона НЗ в начале транскрипционной единицы и триметилированного по К36 гистона НЗ в конце транскрипционной единицы. На основании всего вышесказанного можно сделать один вывод, имеющий более общее значение. Определенная группа модификаций гистонов необходима для привлечения РНК-полимеразы II к промоторным областям. Распределение таких модифицированных (и выполняющих ту же функцию вариантных) форм гистонов в границах транскрипционных единиц и в целом в геноме не зависит от уровня транскрипции. Другие модификации осуществляются в прямой связи с процессом транскрипции. Распределение таких модифицированных гистонов прямо коррелирует с уровнем транскрипции соответствующих областей генома.Сопряженная с транскрипцией смена характера метилирования гистона НЗ имеет большое биологическое значение. Триметилирование H3K36 в дрожжевых клетках способствует привлечению гистондезацетилазы Rpd3S, которая снижает общий уровень ацетилирования гистонов на большей части транскриционной единицы после каждого раунда транскрипции. Вероятно, это необходимо для предотвращения возможности инициации транскрипции внутри гена. Так называемые криптические промоторы, т. е. последовательности ДНК, которые в принципе могли бы служить местами посадки РНК-полимеразы II, встречаются в геноме эукариот достаточно часто. Организация ДНК в стабильную нуклеосомную структуру препятствует активации этих промоторов.

      В заключение данного раздела следует подчеркнуть, что связанные с осуществлением транскрипции модификации гистонов носят динамический характер. С помощью специальных экспериментальных подходов можно наблюдать последовательное ацетилирование-дезацентилирование гистонов, сопряженное с прохождением соответствующих раундов транскрипции.

2.3Доменная организация.

     Эксперименты по изучению  предпочтительной чувствительности  к нуклеазам активных генов  продемонстрировали, что область  предпочтительной чувствительности  к нуклеазам, как правило, оказывается существенно более протяженной, чем транскрибирующийся ген. В ряде случаев предпочтительно чувствительными к нуклеазам оказывались достаточно протяженные (100 т. п. н. и более) геномные домены, включающие как транскрибирующиеся, так и молчащие гены, а также межгенные области. В качестве примеров можно указать домены Р-глобиновых генов позвоночных и домен генов овальбумина кур (рис. 6). Границы ДНКазо-чув- ствительных доменов являются достаточно четкими. Переход от ДНКазо-чувствительной области к области, характеризующейся относительной устойчивостью к ДНКазам, происходит в пределах фрагмента ДНК протяженностью в несколько т. п. н. (рис. 6). Это позволяет предположить, что существуют специальные элементы генома и соответствующие им структуры хроматина, которые являются границами ДНКазо-чувствительных доменов. ДНКазо- чувствительные домены генома привлекли особое внимание исследователей прежде всего потому, что очевидна была определенная зависимость между статусом этих доменов и транскрипционной активностью соответствующих генов.

Рис.6.Профиль чувствительности к ДНКазе I домена гена овальбумина кур.В состав домена входит ген овальбумина (Oval) и два псевдогена (\\fX и у Y). Над схемой домена приведен профиль относительной чувствительности домена и его окрестностей к ДНКазе I в клетках яйцевода, где овальбуминовые гены экспрессируются.

    Можно говорить о том, что ДНКазо-чувствительные домены хроматина являются структурно-функциональными блоками генома, которые могут находиться в активном либо неактивном состоянии в зависимости от типа клеток, или, иными словами, в зависимости от неких дополнительных сигналов. Это положение можно считать основой так называемой доменной гипотезы структурнофункциональной организации эукариотического генома. Данная гипотеза приобрела особую привлекательность после того, как были обнаружены области контроля локуса (locus control regions, LCRs), которые, как следовало из результатов первоначальных экспериментов, осуществляли контроль над всеми параметрами (чувствительность к ДНКазам, транскрипционный статус и время репликации) протяженных доменов генома. Однако все гены, расположенные в активном хроматиновом домене, являются потенциально активными и могут быть быстро вовлечены в транскрипцию. Вопрос о том, как возникает активный хроматиновый домен, до конца не изучен. Понятно, что появление такого домена является результатом сложной цепи событий, превращающей неактивный хроматин в активный. Наиболее важным процессом, приводящим к активации хроматинового домена, является осуществление комплекса сайт-специфических модификаций гистонов. Хотя о доменной организации генома написаны сотни статей, количество изученных модельных систем является весьма скромным.

         В настоящее  время процесс создания активных геномных доменов прямо связывают с процессивным (т. е. распространяющимся) ацетилированием гистонов в рамках всего домена. Прежде всего, этот процесс должен инициироваться в каком-то определенном месте. Согласно современным представлениям, таким местом может быть область контроля локуса, энхансер или промотор. Связанные с этими регуляторными элементами транскрипционные факторы способны привлекать гистонацетилазы. Эукариотические гистонацетилазы входят в состав больших мультисубъ- единичных комплексов. Наряду с собственно гистонацетилазой (например, GCN5 в клетках дрожжей) в состав этих комплексов входят субъединицы, способные взаимодействовать с различными транскрипционными факторами и общими факторами инициации транскрипции. Это способствует привлечению гистонацетилаз к промоторам и энхансерам, где они осуществляют локальное аце- тилирование гистонов. В состав гистонацетилазных комплексов входят и субъединицы, содержащие так называемый бромодомен, который узнает ацетилированные остатки лизина в молекулах гистонов. В связи с этим возникновение области локального ацетилирования гистонов будет способствовать привлечению дополнительных гистонацетилаз, которые будут ацетилировать гистоны в составе соседних нуклеосом, перемещаться на эти нуклеосомы и продолжать процесс распространяющегося ацетилирования (рис. 7). Этот механизм распространяющегося ацетилирования не является единственным. Согласно гипотезе Траверса, элонгирующий комплекс РНК-полимеразы II может сам являться тем транспортным средством, которое используется для перемещения вдоль хроматинового домена факторов ремоделирования хроматина, гистонацетилаз и других белков, необходимых для активации хроматиновых доменов. Соответственно, низкоуровневая транскрипция протяженных геномных доменов может быть необходима для их активации. Основное положение гипотезы Траверса, а именно то, что распространяющийся процесс модификации гистонов осуществляется в непосредственной связи с процессом транскрипции, подтверждено в настоящее время экспериментально

Рис. 7. Механизмы распространения ацетилирования гистонов по хроматиновому домену

Схематически изображены две общепринятые модели. Согласно модели расширяющегося домена (А), локальное ацетилирование привлекает гистонацетилазные комплексы за счет белков с бромодоменами, которые связываются с ацетилированными гистонами. Таким образом, действует положительная обратная связь и происходит распространение ацетилирования. Модель Траверса (Б) предполагает, что гистонацетилазные комплексы взаимодействуют с РНК-по- лимеразой и ацетилируют гистоны по мере элонгации транскрипции.