Генная инженерия

Некоторые из рестриктаз разрезают обе нити ДНК  в одном месте, точно ножом. У  других -- места разреза могут  быть сдвинуты на одной нити ДНК  относительно другой (в пределах сайта  узнавания). В первом случае говорят  о «тупых» концах разреза, во втором -- о «липких» концах обеих нитей  в области разреза. Название «липкие» отражает тот факт, что образующиеся в этом случае на каждой из нитей  короткие однонитевые последовательности нуклеотидов, очевидно, комплементарны друг другу и могут, вообще говоря, вновь соединиться водородными  связями между основаниями. Хотя это, конечно, не восстановит целостности  разрезанного участка ДНК. По крайней  мере до тех пор, пока уже знакомый нам фермент ДНК-лигаза не «зашьет» сделанные рестриктазой разрезы  на каждой из нитей.

Могущество  новообретенного инструмента для  исследований было вполне оценено, когда  примерно в те же годы было сделано  второе важнейшее открытие -существование  плазмид у бактерий.

2.3.Плазмиды

Было обнаружено, что у многих видов бактерий помимо основной массы ДНК, находящейся  в «бактериальной хромосоме» (несколько  миллионов пар оснований) имеются  еще «крошечные» кольцевые, двунитевые и суперскрученные молекулы ДНК. Они были названы плазмидами -- по месту расположения их в протоплазме  клетки. Количество пар оснований  в плазмидах ограничено диапазоном от 2-х до 20-ти тысяч. Некоторые бактерии имеют только по одной плазмиде. В других -- их обнаруживается несколько  сотен.

В норме плазмиды редуплицируются при делении  бактериальной клетки одновременно с основной ДНК хромосомы. Для  своего размножения они используют «хозяйские» ДНК-полиме-разы I, III и  другие ферменты. Плазмиды синтезируют  свои специфические белки, для чего используется РНК-полимераза и рибо-сомы, также принадлежащие бактерии-хозяину. В числе этих «продуктов деятельности»  плазмид иногда оказываются вещества, разрушающие антибиотики (ампимицин, тетрациклин, нео-мицин и другие). Что придает самой бактерии-хозяину  устойчивость против воздействия этих антибиотиков, если она сама по себе таковой устойчивостью не обладает. Мало того. «Самостоятельность» некоторых  плазмид простирается до того, что  они оказываются способными размножаться в клетке бактерии даже тогда, когда  синтез белка в ней (а следовательно, и ее деление) блокированы действием  специфических ингибиторов. В этом случае в бактерии может накопиться до 2-3 тысяч плазмид.

Очищенные плазмиды способны проникать из питательной  среды внутрь клеток чужеродных бактерий, там обосновываться и нормально  размножаться. Правда, для этого  приходится предварительно увеличивать  проницаемость оболочек этих бактерий, обрабатывая их раствором хлористого кальция.

Успешное  встраивание чужой плазмиды удается  лишь для ничтожного меньшинства  клеток обрабатываемой популяции. Однако если бактерия-реципиент не обладала устойчивостью к определенному антибиотику, а «прижившаяся» плазмида эту устойчивость ей сообщает, то даже из единичных успешно «трансформированных» бактерий на питательной среде с добавкой антибиотика можно вырастить вполне полноценные колонии, наследственно обладающие встроенной плазмидой.

Наконец, самое  важное. Если в ДНК плазмиды (до начала трансформации) удастся «встроить» фрагмент вовсе чуждой для нее  ДНК (например ген животного происхождения), то этот фрагмент вместе с плазмидой  войдет внутрь клетки реципиента, вместе с ней будет размножаться и  направлять внутри бактерии синтез «псевдоплазмидных» белков, закодированных в этом гене!

Остается  решить проблему встраивания именно избранного гена в плазмиду. А также  и получения первоначально необходимого количества этого самого гена, если отправным пунктом является известная (хотя бы частично) структура интересующего  нас белка. Вот тут-то и раскроются уникальные возможности использования  рестриктаз.

Но сначала  несколько слов о выделении самих  плазмид из клеток их нормальных бактерий-хозяев. Из бактерии можно очистить суммарную  ДНК, как это было описано раньше. Потом одним из физических методов  отделить низкомолекулярную ДНК  плазмид от сравнительно высокомолекулярной ДНК бактериальной хромосомы. Надо только позаботиться о том, чтобы  при вскрытии клетки не появились  малые обломки основной ДНК. В  частности, не следует пользоваться для разрушения оболочек бактерий ультразвуком.

Можно поступить  проще. Сферопласты бактерий обработать слабой щелочью + DDC-Na или прокипятить  в течение 1 минуты. ДНК бактериальной  хромосомы, вместе со связанными с ней  белками, денатурируется и выпадает хлопьями в осадок. Ее легко удалить  центригурированием. ДНК кольцевых  плазмид также сначала денатурируется. Но поскольку ее однонитевые кольца топологически связаны, они разойтись  не могут. После восстановления нормальных условий среды ренатурируется и  нативная структура плазмид. Они  остаются в растворе.

За последние  годы выделены и очищены сотни  плазмид. Их описание, естественно, начинается с представления полной нуклеотидной последовательности плазмидной ДНК. Современные  автоматические «секвенаторы» позволяют  расшифровать последовательность 4-х-5-ти тысяч пар нуклеотидов за неделю. В 80-е годы, когда секвенирование ДНК производили вручную, такая  работа занимала несколько месяцев.

2.3.Встраивание фрагмента чужеродной ДНК в плазмиду

С помощью  библиотеки плазмид можно без  труда отыскать такую плазмиду, в  ДНК которой имеется (случайно) сайт узнавания для одной из доступных  рестриктаз. Для рестриктаз тоже есть своя библиотека и, как уже упоминалось, порядка 300 их видов имеется в  продаже. Таким образом у исследователя  имеются широкие возможности  выбора наиболее удобной комбинации плаз-миды и рестриктазы.

Далее разрезают  выбранной рестриктазой удобную  плазмиду так, чтобы образовалось два  «липких» конца. Затем нужно снабдить такими же концами фрагменты встраиваемой ДНК. Хорошо, если по обоим концам этого  фрагмента расположатся сайты узнавания выбранной рестриктазы. Но это случай маловероятный. Поступают следующим образом. К собственным окончаниям имеющегося фрагмента ДНК наращивают двунитевые участки искусственных (синтезированных химически) олигонуклеотидов. Заведомо содержащих сайты узнавания выбранной рестриктазы. Затем действием этой самой рестриктазы их превращают в «липкие» концы -- в точности соответствующие липким концам плаз-миды по обе стороны сделанного в ней разреза. (Рассказать о том как наращивают концы фрагмента ДНК было бы, пожалуй, слишком сложно для нашего курса. Зато я немного позже постараюсь пояснить каким образом синтезируются искусственные олигонук-леотиды с наперед заданной последовательностью пар оснований.)

Итак, далее  в буферном растворе смешивают две  ДНК, -- плазмиды и вставки, -- и выдерживают  их при оптимальной температуре  «гибридизации». Чужеродная ДНК «встраивается» в ДНК плазмиды, хотя и может  превышать ее по длине, т. е. д ос-тигать размера в несколько тысяч  пар оснований. Окончательное слияние, «приживание» новой ДНК, разумеется, обеспечивают ДНК-лигазы.

Я употребил  термин «гибридизация». Что он обозначает в данном случае? Условимся называть так образование двухните-вой  структуры в результате контакта двух комплементарных однонитевых  последовательностей нуклеотидов, типа ДНК-ДНК или ДНК-РНК. Термин «комплементарные» нам уже знаком. Последовательности могут быть одинаковой длины, тогда образуется сплошь двухнитевой  «гибрид». А могут быть и существенно  различными по длине. В этом случае образуется «участок гибридизации», соответствующий  длине более короткого из двух партнеров. Минимальная длина участка  гибридизации, при которой он достаточно устойчив, -- это 8-10 пар нуклеотидов. Впрочем, для устойчивой гибридизации комплементарных липких концов двух молекул ДНК эту цифру можно  уменьшить вдвое, так как двунитевые структуры самих ДНК будут  поддерживать новообразованный короткий участок гибридизации.

Может возникнуть вопрос: а почему сама разрезанная  плаз-мида не восстанавливает кольцевую  структуру путем гибридизации своих  собственных липких концов? Ну, во-первых для сравнительно короткой ДНК плазмиды не так-то просто, распрямившись, самопроизвольно  снова свернуться в кольцо. Во-вторых, встраиваемый фрагмент ДНК берется  в большом избытке с тем, чтобы  процесс встраивания в плазмиду имел конкурентное преимущество по отношению  к процессу восстановления плазмиды. С этой же целью 5'-фосфатные группы из места разреза плазмиды убирают  действием еще одного фермента -- «щелочной фосфата-зы». Поначалу достаточно, чтобы соединилась одна пара липких концов, принадлежащих плазмиде и  встраиваемой ДНК. Со временем, непременно, благодаря тепловым движениям соединится и вторая пара.

И все-таки поставленный вопрос не напрасен. Полностью избежать «реставрации» пустых плазмид, действительно, не удается. К счастью найден способ различать среди колоний бактерий, выросших на среде с антибиотиком, те, которые приютили « пустую «  плазмиду от тех, что получили плазмиды со встроенным фрагментом чужой ДНК. Способ этот очень красив. Идея его  такова. Некоторая модификация самой  плазмиды позволяет ей в «сотрудничестве» с основным геномом бактерии E.coli в присутствии некоего хромогенного субстрата (похожего на лактозу) синтезировать  продукт голубого цвета. В результате на чашке с агаром вырастают голубые колонии бактерий. Вставку же чужеродного фрагмента ДНК производят б таком месте, что плазмида утрачивает способность к «сотрудничеству». В результате чего вырастают колонии белого цвета. Их-то и отбирают, чтобы уже в большом объеме жидкой питательной среды наращивать бактериальную массу с плазмидами и чужеродной ДНК. Таким образом решается задача умножения количества («клонирования») интересующей нас ДНК.

                               3.Значение генной инженерии

Генная инженерия  берет свое начало в 1973 году, когда  генетики Стэнли Кохен и Герберт  Бойер внедрили новый ген в  бактерию кишечной палочки (E. coli).

Начиная с 1982 года фирмы США, Японии, Великобритании и других стран производят генно-инженерный инсулин. Клонированные гены человеческого  инсулина были введены в бактериальную  клетку, где начался синтез гормона, который природные микробные  штаммы никогда не синтезировали.

Около 200 новых  диагностических препаратов уже  введены в медицинскую практику, и более 100 генно-инженерных лекарственных  веществ находится на стадии клинического изучения. Среди них лекарства, излечивающие артрозы, сердечнососудистые заболевания, некоторые опухолевые процессы и, возможно, даже СПИД. Среди нескольких сотен  генно-инженерных фирм 60% работают над  производством лекарственных и  диагностических препаратов.

3.1.Генная  инженерия в сельском хозяйстве

К концу 1980-х  удалось успешно внедрить новые  гены в десятки видов растений и животных — создать растения табака со светящимися листьями, томаты, легко переносящие заморозки, кукурузу, устойчивую к воздействию пестицидов.

Одна из важных задач - получение  растений, устойчивых к вирусам, так  как в настоящее время не существует других способов борьбы с вирусными  инфекциями сельскохозяйственных культур. Введение в растительные клетки генов  белка оболочки вируса, делает растения устойчивыми к данному вирусу. В настоящее время получены трансгенные  растения, способные противостоять  воздействию более десятка различных  вирусных инфекций.

Еще одна задача связана с защитой растений от насекомых-вредителей. Применение инсектицидов не вполне эффективно, во-первых, из-за их токсичности, во-вторых, потому, что  дождевой водой они смываются  с растений. В генно-инженерных лабораториях Бельгии и США были успешно  проведены работы по внедрению в  растительную клетку генов земляной бактерии Bacillus thuringiensis, позволяющих  синтезировать инсектициды бактериального происхождения. Эти гены ввели в  клетки картофеля, томатов и хлопчатника. Трансгенные растения картофеля  и томатов стали устойчивы  к непобедимому колорадскому жуку, растения хлопчатника оказались  устойчивыми к разным насекомым, в том числе к хлопковой совке. Использование генной инженерии позволило сократить применение инсектицидов на 40 - 60%.

Генные инженеры вывели трансгенные растения с удлиненным сроком созревания плодов. Такие помидоры, например, можно снимать с куста  красными, не боясь, что они перезреют  при транспортировке.

Список растений, к которым успешно применены  методы генной инженерии, составляет около  пятидесяти видов, включая яблоню, сливу, виноград, капусту, баклажаны, огурец, пшеницу, сою, рис, рожь и много других сельскохозяйственных растений.

3.2.Генная  инженерия животных

Мощное развитие животноводства за последние десятилетия  привело к появлению выдающихся пород животных. Продуктивность молочного  скота у некоторых пород достигла 8-9 тыс.кг. Новый сибирский тип  российской мясо-шерстной породы овец отличается высокой мясной и шерстной продуктивностью. Средняя масса  плембранов составляет 110-130 кг, средний  настриг шерсти в чистом волокне 608 кг. Лучшие породы кур дают по 400 яиц  в год на несушку, а бройлерные цыплята достигают массы 2,5 – 3 кг за семь недель. Примеры выдающихся достижений селекции можно перечислять  очень долго.

За  предшествующие 100 лет в деле улучшения  растений и животных селекция сделала  поразительные успехи. Сегодня во многих развитых странах получают рекордные  урожаи пшеницы, риса, кукурузы. Считается, что конечный результат в растениеводстве  на 50% зависит от уровня урожайности  сорта, на такую же величину от совершенства технологии земледелия и возделывания растений. Столь же внушительные результаты получены и в животноводстве. В  процессе селекции созданы породы крупного рогатого скота, дающие более 10 тыс. кг молока на корову за год. Естественно, что и в животноводстве, кроме  породы, большую роль играет

технология  содержания и кормления животных. Однако как у растений, так и  у животных определяющей компонентной конечной продуктивности является биологический  потенциал сортов и пород, созданный  в процессе селекции. В качестве иллюстрации рассмотрим очень распространенную культуру – картофель.  Сегодня  создаются и возделываются