Современные тесты и приборы для биофармацевтической оценки лекарственных форм и систем

 

Оценка высвобождения лекарственных веществ из мягких лекарственных форм (МЛФ), например мазей, определяется способностью основы высвобождать лекарственные вещества.

В настоящее время разработано и предложено много различных методов по определению высвобождения лекарственных веществ мазевыми основами. Все эти методы можно разделить:

- на модельные опыты in vitro, основанные на физико-химических и микробиологических исследованиях;

- биологические методы in vivo, проводимые на живых организмах или изолированных органах.

Результаты биологических методов не всегда воспроизводимы, поэтому для сравнительных исследований применяют опыты in vitro.

Для получения сравнимых результатов необходимо поддерживать постоянную температуру, одинаковый состав опытной среды, одинаковые концентрации лекарственного вещества, использовать образцы аналогичной величины с одинаковой степенью дисперсности суспендированного или эмульгированного вещества.

 

2.4.1. Физико-химические и микробиологические методы

 

К этой группе методов следует отнести метод агаровых пластинок. Суть метода состоит в том, что небольшое количество испытуемой мази наносят на агаровый гель, содержащий реактив, который образует окрашенные соединения с лекарственным веществом. По мере диффузии лекарственного вещества из мази окрашенная зона геля увеличивается. Линейными размерами этой зоны и может быть измерена степень диффузии вещества из мази. Техника проведения метода упрощается при использовании красителя в качестве диффундирующего вещества. Если вещество способно флюоресцировать, то для его идентификации применяют аппарат для флюоресцентного анализа.

В том случае, если действующие вещества обладают антисептическими или бактерицидными свойствами, применяют микробиологический тест, который отличается от предыдущих методов способом идентификации. Определенное количество мази вносят в цилиндрическое отверстие, сделанное в агаре, содержащем стандартную культуру микроорганизма. Микроорганизмы на питательной среде не растут там, где для них образуется минимальное тормозящее или губительное действие диффундирующего из мази вещества. Таким образом, вокруг мази образуется зона торможения, которая отсутствует при применении неподходящей мазевой основы. Диаметр или ширина зоны торможения, характеризующая степень диффузии лекарственного вещества из мазевой основы, измеряется через 24 или 48 ч инкубации чашек Петри с агаром в термостате (37 °С).

Время измерения зон зависит от скорости диффузии вещества.

Наиболее часто используются методы прямой диффузии, когда мазевая основа находится в непосредственном контакте со средой (раствором, гелем и др.), в которую должно диффундировать лекарственное вещество.

При применении хроматографического метода необходима фильтровальная бумага, увлажненная раствором индикатора. Мазь помещается в центре фильтровальной бумаги в небольшом цилиндре, открытом с обоих концов. Скорость диффузии определяется путем измерения расстояния от наружного края мази до наружного края окрашенной зоны на фильтровальной бумаге.

Сравнительно широко распространенным тестом для определения высвобождения лекарственных веществ из мазей является метод диффузии через мембрану, когда изучаемая мазь отделяется от диффузионной среды какой-либо полупроницаемой мембраной. В качестве мембраны используют различный материал (наиболее часто — целлофан). Толщина целлофановой пленки оказывает незначительное влияние на диффузию, а материал не вступает во взаимодействие с лекарственными веществами.

Процесс исследования заключается в том, что определенное количество мази помещается в камеру для диализа, которая погружается в физиологический раствор. Исследование проводится при температуре 37 °С. Диффундированное лекарственное вещество определяют обычными химическими или физико-химическими методами.

Чтобы приблизить условия опыта к условиям намазывания мази на кожу, использовали устройство, в котором в процессе определения диффузии веществ предусматривается перемешивание мази. Для приближения опыта к биологическим условиям применялись мембраны животного происхождения (например яичная оболочка, слепая кишка ягненка, брюшина рогатого скота, кожа с затылка кролика и другие) и соответствующая среда.

В процессе разработки методик с микробиологической детекцией было предложено множество вариантов усовершенствований, которые можно объединить в три типа в соответствии с тем, как вносится образец в культуру микроба, находящегося в питательной среде.

Часто используемым методом является метод, при котором на полотне с культурой микроба (обычно пептоновый агар) делается небольшое круглое отверстие и заполняется пробой мази. Важно, чтобы образец находился в тесном контакте с питательной средой на всей поверхности отверстия, что надежнее достигается нанесением подогретого образца в полутвердом состоянии. При сравнении результатов надо следить за тем, чтобы высота питательной среды в чашке Петри была одинаковой, среда имела всегда одинаковый рН и не наблюдалось разницы в содержании других веществ, внесенных в питательную среду.

Другой возможностью усовершенствования опытов может быть размещение образца мази в металлическом (алюминиевом) цилиндре на питательной среде.

Третья возможность — это нанесение образца на бумагу (диск в диаметре до 1 см), которая кладется на твердую питательную среду.

 

2.4.2. Методы с химической (физико-химической) детекцией

 

При этих методах для оценки высвобождения лекарственного вещества можно наблюдать или диффузию в жировой среде, или диффузию в водной среде в форме гидрогеля, или проникание в жидкую среду.

Диффузия в жировой среде (без перехода через полупроницаемую мембрану) может исследоваться следующим образом: образец мази наносится на площадь, обозначенную на фильтровальной бумаге, которая кладется на раствор, представляющий рецепторную фазу. Закрытая чашка оставляется на 4 ч в термостате при температуре 25 °С. Степень диффузии вещества определяется количественно в рецеп-торной фазе.

Другая разновидность этого же метода такова: образец наносится на фильтровальную бумагу, помещается на дно чашки Петри, заливается, например, вазелином и оставляется на 12 ч при температуре 30 °С. В вазелине определяется количество высвобожденного лекарства. Аналогичный подход существует и для веществ гидрофильного характера. В этом случае образец заливается водой.

Если речь идет о гидрофобной мази, то ее можно исследовать прямой диффузией: мазь в растопленном виде наносится на водную рецепторную фазу.

Диффузия в водной среде. Техника диффузии в среде в форме гидрогеля аналогична технике опытов с микробиологической индикацией на полотнах питательной среды. Гидрогель выбирается по консистенции, преимущество отдается желатиновым гидрогелям, а не агаровым. Нужно следить, чтобы образец мази имел очень тесный контакт с гелем, поскольку фазовая реакция должна быть выразительной, а граница цветовой зоны — четкой. Недостатком этих методов является тот факт, что измерение диаметра окрашенной зоны сопряжено с довольно большой экспериментальной погрешностью. Воспроизводимость результатов зависит от способа подготовки геля и полотна, от химического состава показателя детекции, от постоянства окраски образующегося соединения, продолжительности выдержки и температуры.

Рецепторная фаза может быть водной (вода, физиологический раствор, раствор Рингера, буферные растворы) или безводной. Лекарственное вещество, которое в нее переходит, определяется химическими или физико-химическими, а в настоящее время, как правило, спектральными методами. Приспособления для этих опытов просты. Наиболее распространенные из них схемы представлены на рис. 10 и 11.

Рис. 10. Устройство для исследования проникания лекарственного вещества из мази в жидкую среду: А — трубочка с образцом мази; В — рецепторная фаза; С — целлофан. Опыт проводится при температуре 37 °С. Рецепторная фаза — раствор Рингера, мазь содержит красящее вещество, например метиленовый синий

 

Рис. 11. Устройство для исследования проникания лекарственного вещества из мази в жидкую среду: А — камера, заполненная образцом мази; В — рецепторная фаза; С — целлофан. Камера может быть снабжена мешалкой

 

2.5. Высвобождение лекарственных веществ из ректальных лекарственных форм

 

Оценка высвобождения лекарственных веществ из ректальных лекарственных форм (РЛФ) определяется способностью основы высвобождать лекарственные вещества. Существуют два основных подхода к определению высвобождения: инструментальный (in vitro) и биологический (in vivo). Для сравнительных исследований применяют опыты in vitro, которые базируются на физико-химических и микробиологических методах.

Широко применяется метод агаровых пластинок, который отличается от такового для мазей способом нанесения суппозиторной массы на агаровый гель. Для лучшего контакта с рецепторной фазой суппозитории необходимо расплавить. Степени диффузии лекарственного вещества оценивают линейными замерами окрашенной зоны. Если действующие вещества обладают антисептическими или бактерицидными свойствами, применяют микробиологический тест.

Также применимыми для суппозиториев являются методы прямой диффузии, диффузии через мембрану и хроматографический метод.

Фармакопея СССР (изд. XI) предлагает метод Крувчинского — метод равновесного диализа через полупроницаемую мембрану из природных или синтетических материалов.

Фармако-технологические требованиям фармакопеи США, Германии, Европейского Союза, Японии регламентируют для суппозиториев проведение испытаний на распадаемость и растворимость.

Испытание на распадаемость позволяет определить, размягчаются или распадаются ректальные или вагинальные суппозитории в течение установленного времени, если они помещены в жидкую среду в экспериментальных условиях, указанных ниже.

Считается, что образцы распались, если:

а) наблюдается полное растворение;

б) компоненты суппозитория разделились — расплавленные жировые вещества собрались на поверхности жидкости, нерастворимые частицы осели на дно, а растворимые компоненты растворились;

в) размягчение образца сопровождается заметной сменой формы, без полного разделения компонентов или отсутствием у суппозитория твердого ядра, оказывающего сопротивление давлению стеклянной палочки.

Прибор (рис. 12) состоит из прозрачного стеклянного или пластмассового пустого цилиндра 1 с соответствующей толщиной стенок. Внутри цилиндра с помощью трех зажимов 2 закреплено металлическое приспособление, которое представляет собой два перфорированных диска 3 из нержавеющего металла, закрепленных на расстоянии приблизительно 30 мм друг от друга. Диаметр дисков почти равняется внутреннему диаметру цилиндра, и в каждом диске имеется 39 отверстий диаметром 4 мм.

Испытания проводят, используя три таких приспособления, каждое из которых содержит отдельный образец 5.

Каждое приспособление помещают в резервуар 6 с тер-морегулирующим устройством объемом не менее 4 л, заполненный водой 7 с температурой от 36 до 37 °С, если нет других указаний в частной статье, и прикрывают стеклянной крышкой 4.

Резервуар снабжен свободно вращающейся мешалкой и механизмом, который поддерживает его в вертикальном положении не менее чем на 90 мм ниже поверхности воды и дает возможность переворачивать его на 180°, не вынимая из воды. Три приспособления можно также поместить одновременно в один резервуар вместимостью 12 л.

Методика. Испытывают три суппозитория. Каждый образец помещают на нижний диск приспособления, устанавливают приспособление в цилиндр прибора и закрепляют его. Прибор опускают в резервуар с водой и начинают испытание. Прибор переворачивают каждые 10 мин. После окончания времени, указанного в общей или отдельной статье, исследуют образцы. Препарат выдерживает испытание, если все образцы распались.

Рис. 12. Прибор для определения распадаемости суппозиториев и пессариев

 

Различные модели приборов для определения распадаемости и растворимости суппозиториев выпускаются производителями аналитического оборудования. Например, прибор фирмы PharmaTest (Германия), модель PTS ЗЕ (рис. 13) и PTS WO.

Прибор проверки распадаемости свечей PTS ЗЕ позволяет проводить тестирование трех образцов. Время тестирования может быть установлено от 1 мин до 10 ч, при этом точка распадаемости фиксируется вручную. Во время работы контейнер поворачивается на 180°. Прибор имеет съемные баню и держатель.

Прибор для проверки растворимости свечей PTS WO работает в нормальной бане для растворения, ячейка помещается в обычный сосуд для растворения, привод мешалки соединяется с горизонтально вращающейся диализной ячейкой. Действующие составляющие диффундируют через мембрану ячейки и могут быть измерены обычным способом.

Рис. 13. Прибор PTS 3E для определения распадаемости суппозиториев фирмы PharmaTest (Германия):