Применение ПААГ-электрофореза для анализа белковых фракций, полученных из культуры Hansenula polymorpha NCYC 495ln

     Чувствительность  окрашивания белков многократно  увеличивается при использовании  перечисленных ниже флюоресцентных красителей. Многие из них связываются с белками или пептидами, в основном по концевым аминогруппам. Их также можно использовать для наблюдения за ходом электрофореза после предварительной обработки исходного препарата. Рассмотрим теперь подробнее наиболее распространенные марки красителей и особенности их применения.

     2.5.1. Кислые красители

     Исторически для окраски белков в геле были прежде всего использованы давно апробированные промышленные красители для шерсти — сложные молекулы с несколькими ароматическими кольцами и заряженными группами. Механизм их взаимодействия с белками еще далеко не ясен. По-видимому, первоначальное связывание идет за счет кулоновского взаимодействия сульфогрупп красителей с положительно заряженными аминокислотными остатками в белке. Затем оно, вероятно, закрепляется ван-дер-ваальсовскими, водородными, а возможно, и гидрофобными связями [1].

     Какой бы буфер ни использовался при  электрофорезе, к моменту окрашивания  он замещается на довольно крепкий  раствор (10% и более) уксусной кислоты  или ТХУ, поэтому преимущественный заряд любого белка оказывается  положительным за счет остатков лизина, аргинина и гистидина, так что  для белков используются преимущественно  кислые красители, несущие остатки  сульфокислоты. Они сохраняют свой отрицательный заряд и при  низких значениях рН.

     Двадцать  лет назад широко использовали «амидо-шварц» – краситель с фирменным названием «Amido Black 10B» (сейчас его выпускают под названием «Naphthalene Black 12B»). Его растворяли до концентрации 1% в 7%-ном растворе уксус- 
ной кислоты. В настоящее время его вытеснил другой краситель – кумасси ярко-голубой («Coomassie brilliant blue», сокращенно СВВ). Этот краситель дает лучшую чувствительность и линейную зависимость интенсивности окраски от концентрации белка в более широком ее диапазоне. Краситель выпускают в двух модификациях: R-250 и G-250.

     

Рис. 4. Кумасси G-250

     Обилие  ароматических колец в структуре  красителей типа СВВ делает их плохо  растворимыми не только в воде, но и  в разбавленной уксусной кислоте. Для  улучшения растворимости к кислоте  часто добавляют метанол. Обычно используют водные растворы, содержащие 9—10% уксусной кислоты и 40—45% метанола (по объему), однако рабочая концентрация СВВ R-250 в этой смеси составляет 0,1—0,25%, реже 0,5%. Иногда СВВ R-250 растворяют в 25%-, 50%-ной ТХУ или в смеси, содержащей 10% ТХУ и 25% изопропанола (остальное – вода). Возможны и другие варианты, не меняющие существа дела: краситель должен полностью раствориться в кислом растворителе, осаждающем белок.

     Продолжительность окрашивания зависит от толщины  и пористости геля и может варьировать  от 2 – 3 до 12 ч. Для ускорения процесса можно окрашивать гель при 37°, а ванночку с раствором красителя покачивать. Отмывку от не связавшегося с 
белком красителя ведут, как описано выше, например, вымачивая гель в 7%-ной уксусной кислоте или в смеси, содержащей 7,5% уксусной кислоты и 5% метанола. В этих условиях растворимость красителя достаточна для вымывания его свободных молекул, а десорбция его с белка незначительна. Если электрофорез вели в присутствии высокой концентрации мочевины, то лучше отмывать смесью, содержащей 7,5% уксусной кислоты и 20% метанола [1].

     Гель  из трубки отмывают в пробирке, пластину геля – в ванночке. При окрашивании  соотношение объемов жидкости и  геля должно составлять примерно 3:1, при  отмывке – 5:1 или даже 10:1 с двумя-тремя  сменами растворителя. Если в растворитель добавлена ионообменная смола, то его  менять не нужно.

     После окрашивания СВВ R-250 можно качественно, но вполне надежно обнаружить полосу, содержащую 10 мкг белка. На порядок более высокую чувствительность окраски можно получить с помощью красителя СВВ G-250. Для этого используют относительно плохую его растворимость в хлорной кислоте. Готовят 0,04%-ный коллоидный раствор красителя в 3,5%-ном водном растворе НС1O₄, фильтрованием освобождаются от крупных, не растворившихся частиц. В полученном коричневом растворе вымачивают гель в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Сорбция на белке сдвигает равновесие в сторону диссоциации коллоидных частиц; краситель связывается с белком и окрашивает его в синий цвет (коричневая окраска была обусловлена наличием коллоидных частиц). На геле при этом краситель не сорбируется. Синеватые полосы белка проступают на бледно-коричневом фоне геля уже через 30 мин. По истечении 1,5 ч гель переносят в 5%-ный раствор уксусной кислоты. Интенсивность окраски полос при этом увеличивается, а фон становится прозрачным и светло-голубым – часто его можно не отмывать.

     Для окрашивания гистонов после электрофореза  иногда используют краситель «Fast green FCF». Его можно использовать и для других белков. Он менее чувствителен, чем СВВ, но более надежен для количественных оценок содержания белка в полосах путем денситометрирования, так как при отмывке геля СВВ в большей степени, чем «Fast 
green», вымывается из белковых полос, причем иной раз неодинаково для различных белков.

     Во  всех описанных способах белки перед  окрашиванием или в его процессе фиксируют осаждением кислотой и  спиртом. Однако некоторые основные белки (например, рибонуклеаза и протамин), а также низкомолекулярные пептиды и гормоны при такой обработке не осаждаются, а, наоборот, растворяются и вымываются из геля.

Поэтому был предложен принципиально  иной подход к фиксации белков и  пептидов в геле после электрофореза. Гель в течение 1 ч вымачивают в 5%-ном  растворе формальдегида в 25%-ном  этаноле с добавлением СВВ R-250 до 0,11%. В этих условиях формальдегид ковалентно сшивает пептиды с матрицей геля за счет образования метиленовых мостиков между аминогруппами аминокислот и первичными аминами ПААГ. Гели с после SDS-электрофореза красят более продолжительное время (до 3 ч) в 3,5%-ном растворе формальдегида. Отмывку гелей ведут в течение ночи в 3,5%-ном растворе формальдегида в 25%-ном этаноле.

     2.5.2. Другие красители и методы окрашивания

     Определенные  затруднения возникают при окраске  кислых фосфопротеидов, например фосфитина. Наличие отрицательно заряженных остатков фосфорной кислоты мешает окрашиванию анионными красителями. Конечно, можно использовать такие положительно заряженные (катионные) красители, как толуидиновый синий или акридиновый оранжевый, но они дают высокий уровень фона. Есть возможность пойти другим путем. Известна высокая степень сродства фосфопротеидов к трехвалентным металлам, поэтому можно использовать ионы А1³⁺ для блокирования зарядов фосфатов. Это позволит успешно вести окрашивание белков кислым красителем. Так, для фосфопротеидов была рекомендована следующая смесь: 0,05% СВВ R-250+0,1 M A1(NO₃)₃+10% уксусной кислоты + 25% изопропанола + 1% Тритона Х-100. Отмывают гель, как обычно, в 7%-ной уксусной кислоте. Гликопротеиды, белки, липиды и даже нуклеиновые кислоты 
можно окрасить одновременно красителем с выразительным 
фирменным названием «Stains-all», формула которого представлена на рис. 5.

Рис. 5. Краситель  «Stains-all»

     Замечательно, что разные по своей природе биополимеры  окрашиваются при этом в различные  цвета: гликопротеиды – в синий, белки – в красный, липиды –  в желто-оранжевый, ДНК – в синий, а РНК – в голубовато-пурпурный. Однако по чувствительности этот универсальный краситель заметно уступает специализированным. Кроме того, он обесцвечивается при контакте с ДСН, который из-за этого приходится отмывать после электрофореза, вымачивая гель в течение 18—36 ч в 25%-ном растворе изопропанола [1]. 
 
 
 
 
 

     3. Алкогольоксидаза и её биохимические свойства.

     Алкогольоксидаза – фермент, относящийся к классу лксидоредуктаз и катализирующий присоединение кислорода к субстрату (в данном случае к алкоголям).

     Свойства  АО весьма близки у различных метилотрофных дрожжей. Это, как правило, откамерный флавопротеид с молекулярным весом 300-675 кДа и весом субъединиц 65-84 кДа. Фермент, как правило, нестабилен в кислой среде и при высоких значениях температуры. Однако, в зависимости от вида и даже штамма дрожжей некоторые молекулярные и кинетические праметры АО могут отличаться.

     АО  обладает достаточно широкой субстратной специфичностью. Наибольшее значение скорости катализа АО наблюдается с метанолом, естественным субстратом. В порядке увеличения длины радикалов и степени разветвления спирты становятся менее доступными для АО [25].

     3.1. Роль АО в метилотрофном метаболизме дрожжей.

     Способность использовать метанол в качестве источника углерода и энергии  обнаружена лишь у нескольких видов  дрожжей, относящихся к видам  Hansenula, Pichia, Candida, и Torulopsis. Среди них наиболее изученными являются Hansenula polymorpha, Candida boidinii и Pichia pastoris [26].

     Первым  и ключевым ферментом метаболизма  метанола у метилотрофных дрожжей является алкогольоксидаза (АО, ЕС 1.1.3.13), локализованная в пероксисомах (ПС) и окисляющая метанол до формальдегида и перекиси водорода

      СН₃ОН + О₂             СН₂О + Н₂О₂

            У большинства дрожжей АО является  гомооктамером с молекулярной массой нативного белка (м.м.) до 600 кДа и Mr субъединиц 72-80 кДа, содержащих одну молекулу нековалентно связанного кофактора: ФАД или его стереоаналог, мФАД.

           Продукты реакции, катализируемой  АО, формальдегид и Н₂О₂, высокотоксичные соединения, внутриклеточные уровни которых эффективно регулируются во избежание гибели клеток. При этом Н₂О₂ разлагается каталазой до Н₂О и О₂, а формальдегид поступает в пути прямого окисления и ассимиляции [27].

 

4. Экспериментальная часть.

   4.1. Методика выращивания дрожжей Hansenula polymorpha NCYC 495ln

      Таблица 1. Основные вещества, входящие в состав питательной среды

 

Данный набор  компонентов является стандартным  для среды культивирования дрожжевых  клеток.

     Таблица 2. Состав микроэлементов.

 

            Процесс культивирования включал следующие этапы:

1. Приготовление питательной среды.

В несколько колб было помещено по 200 мл среды. Колбы помещены на стерилизацию.

Условия стерилизации:

• Температура – 120⁰С
• Давление – 1атм (сверх атмосферного давления)
• Время – 60 минут

 

2. Внесение  инокулята в первую колбу, с целью получения молодых быстроделящихся клеток.

     После стерилизации колбы охлаждают до комнатной температуры. Далее в  одну из них помещается малое количество дрожжевых клеток, затем колба  помещается на 14-18 часов в шейкер – инкубатор. Этому времени инкубации соответствует период активного роста клеток.

3. Пересеивание клеток в оставшиеся колбы и получение максимального количества биомассы.

     Из  колбы отбирают по 10мл клеточной  суспензии в оставшиеся колбы и далее все  колб помещают в шейкер – инкубатор на 24 часа. Условия инкубации: температура – 28⁰С; число оборотов – 190об/мин. Полученную биомассу центрифугируют при 8000g в течение 30 мин.