Ферментация

   Вакуум-выпаривание. Вакуум-выпаривание как способ концентрирования широко распространен в химической и фармацевтической промышленности. При получении микробных метаболитов концентрация целевых продуктов в исходных растворах в большинстве случаев очень низкая (менее 1%), поэтому применение методов осаждения или непосредственного высушивания неэкономично.

   Биологически  активные вещества, синтезируемые микроорганизмами, как правило, обладают высокой термочувствительностыо. Во избежание потерь при выпаривании к аппаратуре предъявляются строгие требования: низкая температура испарения, кратковременный контакт с теплоносителем, возможность организации непрерывного процесса, особые конструкции, обеспечивающие выпаривание вязких жидкостей.

   Благодаря  прогрессу в  вакуум-выпарной технике  время  контакта с теплоносителем уменьшилось с часов до минут  и даже секунд.

   Вымораживание. Все более широкое распространение как для концентрирования, так и обессоливания растворов находит вымораживание. Концентрирование вымораживанием основано на превращении воды в кристаллы льда с последующим механическим отделением их. При вымораживании важное значение имеют содержание воды и характер связывания ее с материалом, глубина и скорость вымораживания, величина и форма образующихся кристаллов, обусловленная тепловым обменом и временем кристаллизации.

   Множество схем вымораживания строится в основном по трем принципам: многоступенчатое замораживание; одноступенчатое замораживание  с рециркуляцией; распыление раствора на холодной поверхности.

   При механическом отделении кристаллов льда (центрифугирование, вакуум-фильтрация, сепарирование) наблюдаются потери концентрата, которые тем больше, чем выше концентрация полученного концентрата. Во избежание этих потерь проводят переменное частичное подтаивание массы снега и двух-, трехкратное центрифугирование.

   Несмотря  на возможные потери, эксплуатация вымораживающих установок дешевле, чем выпарных аппаратов. Особенно перспективен этот метод при получении высокоочищенных ферментных препаратов.

   Осаждение. Осаждение белков из водных растворов основано на изменении их растворимости при добавлении определенных веществ. Для получения очищенных ферментных препаратов в лаборатории широко применяют метод высаливания белков. Осаждение белка зависит от ряда факторов, влияющих па их растворимость, в основном от величины рН и концентрации раствора. Степень насыщения обрабатываемого раствора сульфатом аммония изменяется в очень широких пределах; в большинстве случаев ее находят эмпирически из-за сложности состава разделяемых смесей. Более того, степень насыщения неорганической солью различна на разных стадиях очистки и зависит от используемого. продуцента-микроорганизма.

   Степень насыщения электролитом также специфична для осаждения каждого конкретного белка. Это легло в основу методов фракционирования биополимеров постепенным изменением степени насыщения электролитом. Использование фракционного высаливания сернокислым аммонием особенно целесообразно в случае ферментного комплекса и может успешно конкурировать с осаждением органическими растворителями.

   Известно  применение флотоагентов (толуола, жидких парафинов и др.). Среди реагентов, способных специфически связывать и осаждать ферменты, значительную роль играют растворимые синтетические или природные полимеры и полиэлектролиты.

   При получении ферментов, в частности  гидролаз, из культу-ральных жидкостей  рекомендовано использовать танин  и белковые добавки — желатину, казеин, сыворотку, пептон или желатину с добавлением танина.

   Кроме перечисленных полимеров способностью осаждать белки обладают и другие заряженные полимеры, такие, как ДЭАЭ-декстран, сульфат декстрана, полиэтиленимин, сульфат протамина.

   Помимо  осаждения полиэлектролитами известны способы образования малорастворимых соединений. На этом приеме, например, основана производственная технология выделения лимонной кислоты из культуральных жидкостей Aspergillus niger. Применение ионообменных и экстракционных процессов, а также прямой кристаллизации неэффективно из-за высокого содержания примесей, вносимых в питательную среду мелассой, и присутствия других органических кислот. Нейтрализация культуральной жидкости лимонной кислоты гидроокисью кальция или мелом в определенных условиях — при рН 6,8—7,0 и температуре 100°С — сопровождается образованием малорастворимого цитрата кальция. Частично происходит также осаждение кальциевых солей щавелевой, яблочной и сахарной кислот. Осадок затем промывают горячей водой и подвергают разложению под воздействием концентрированной серной кислоты. Полученный раствор лимонной кислоты (вместе с промывными водами),имеющий концентрацию не ниже 16%, поступает на вакуум-выпаривание и кристаллизацию. Фильтрат культуральной жидкости после отделения цитрата кальция упаривают и используют в качестве кормовой добавки.

   Осаждение органическими    растворителями, проводимое    при охлаждении, — один из распространенных способов концентрирования ферментных растворов. Он имеет ряд преимуществ перед  высаливанием, в частности возможность  регенерации, что положительно сказывается на экономических показателях процесса. Однако органические растворители не обладают способностью избирательного осаждения белков.

   Мембранные  процессы. В настоящее время в микробиологической и химико-фармацевтической промышленности все шире получают распространение сложные термически и химически лабильные органические соединения. Для качественного выделения этих веществ требуются «мягкие» условия производства, которым в значительной степени отвечают мембранные процессы. Внедрение мембранных процессов позволяет интенсифицировать технологию концентрирования биологически активных веществ, сокращая при этом потери каталитической активности. Мембранные методы разделения смесей, содержащих ферменты, значительно повышают качество продукции.

   Основой разработки современных экономичных  мембранных процессов явилось получение  и последующее усовершенствование высокоселективных ацетатцеллюлозных  и синтетических мембран. Так, за 10 лет, прошедших со времени получения  мембран из ацетата целлюлозы, их проницаемость удалось увеличить  примерно в 100 раз. Создание так называемых динамических мембран позволило повысить проницаемость по сравнению с мембранами из ацетата целлюлозы в 2,5 раза.

   Среди жидкофазных мембранных процессов  различают: диализ, электродиализ (преимущественно с использованием ионообменных мембран); ультрафильтрацию, обратный осмос.

   Ультрафильтрация, функционально напоминающая обыкновенную фильтрацию, — первый физический прием концентрирования очень разбавленных растворов, находящий широкое применение как в биотехнологии, так и в научных исследованиях. Применение ультрафильтрации имеет ряд преимуществ: исключается денатурация белка, так как процесс идет без фазовых превращений при любой температуре, когда смесь находится в жидком состоянии и растворенное вещество не испытывает влияния рабочего давления; возможны одновременное концентрирование и очистка от минеральных и низкомолекулярных органических веществ; незначительные затраты энергии, ультрафильтрационные установки отличаются простотой конструкции и эксплуатации.

   Метод ультрафильтрации незаменим в непрерывных  процессах — выделение ферментов при ферментации, отделение биокатализаторов от полученного продукта в мембранных реакторах, очистка сточных вод и утилизация производственных отходов. Недостатком является эмпирический подход к подбору мембран для определенной стадии выделения биопрепарата. Теоретически предсказать ультрафильтрационные свойства растворов сложного состава невозможно, так как мембраны обычно стандартизируют чистыми веществами с определенной молекулярной массой.

   Схемы получения высокоочищенных и  кристаллических ферментных препаратов почти все включают ионообменную хроматографию, влекущую за собой некоторое разбавление растворов. Методы концентрирования их — лиофилизация, вакуум-выпаривание или вымораживание — вызывают значительную инактивацию ферментов.

   Применение  ультрафильтрации для концентрирования растворов ферментов заманчиво простотой исполнения. Однако на этот процесс влияют многие факторы, связанные со свойствами мембран, концентрируемых жидкостей, техникой фильтрации и ограничивающие его применение. Рациональное ведение процесса ультрафильтрации требует тщательной подготовки раствора.

   Сорбция. В последние десятилетия широко развернулись исследования по применению сорбционных процессов при выделении продуктов микробного синтеза. Теория и практика применения ионного обмена наиболее интенсивно развивались в производстве аминокислот и антибиотиков.

   Существует  значительный разрыв между технологическими и лабораторно-препаративными методами выделения ферментов. В технологии, как правило, используют приемы фракционного осаждения, в лабораторной практике — методы гель- и ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии, электрофореза и др. Увеличение масштабов этих процессов от лаборатор ных до технологических — задача сложная, так как используемые в лабораторной технике материалы не имеют удовлетворительных гидродинамических характеристик, исключающих возможность, интенсификации процессов.

   Подбор  ионитов и режимов сорбции, регенерации, промывки специфичны для конкретного  процесса, поэтому подробнее на них  не будем останавливаться.

   Кристаллизация  и сушка. Ряд продуктов микробиологического синтеза, в частности органические кислоты и некоторые аминокислоты, могут быть выделены из культуральных жидкостей прямой кристаллизацией.

   Разработан  и внедрен в производство способ получения итаконовой кислоты по следующей схеме: осветление культуральной жидкости активированным углем в количестве 0,3—0,5 об.%; 8— 10-кратное упаривание под вакуумом при 50—60°С; кристаллизация и отделение кристаллов центрифугированием. Выход технической итаконовой кислоты составляет 80%.

   Глутаминовую  кислоту можно получить путем  кристаллизации ее из упаренных культуральных жидкостей с выходом 73%, при условии, что исходное ее содержание не менее 20 г/л.

   Метод прямой кристаллизации, однако, осуществим только npir условии, что используемые компоненты питательных сред мало-окрашенны и не содержат больших количеств балластных веществ. При содержании в питательных средах мелассы кристаллизация органических кислот и аминокислот сопровождается большими потерями и экономически невыгодна.

   Помимо  прямой кристаллизации производится большое  количество препаратов, где кристаллизации подвергаются растворы различной степени очистки и концентрирования.

   Обезвоживание термочувствительных продуктов микробного биосинтеза — технологически сложный процесс. При выборе метода и режима сушки материалов различной природы основным: критерием служит качество сухого продукта. Применение тепловой сушки требует определить влияние на продукт температуры и времени нагрева, т. е. его термоустойчивость.

   В сушке различных медицинских  препаратов находит все большее применение сублимационный способ. Сублимационное высушивание защищает биологические материалы в процессе их хранения, так как без влаги многие химические, физические и ферментативные процессы затормаживаются или прекращаются. Можно сказать, что сублимационная (лиофильная) сушка — наиболее прогрессивный метод обезвоживания биологических препаратов.

   В СССР выпускают лиофилизированные  установки типа ТГ-5, ТГ 15 и. ТГ-50 (цифра  обозначает количество литров удаляемой  за  цикл  влаги),  из  зарубежных  наиболее  популярны  установки: фирм    «Фригера»    (ЧССР),    «Лейбольд»     (ФРГ),    «Хохвакуум» (ГДР).

   Несмотря  на значительную термолабильность ферментов, показана возможность использования для получения сухих препаратов распылительной сушки. Простота конструкции и удобство в эксплуатации распылительных сушилок обусловили широкое их применение. На предприятиях Министерства медицинской и микробиологической промышленности СССР успешно работают отечественные и зарубежные распылительные установки, например сушилки СРЦ Сумского машиностроительного завода производительностью по испаренной влаге от 1 до 15 т/ч. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

   ЗАКЛЮЧЕНИЕ 

   В заключение следует еще раз подчеркнуть, что вышесказанное можно рассматривать лишь как общее представление о методах выделения, очистки и концентрирования продуктов биотехнологии. Они очень специфичны, очень быстро развиваются, и фактически можно представить целый обзор по выделению и препаративным формам большинства выпускаемых промышленностью продуктов. Однако углубление в проблемы в такой степени не является нашей задачей и не входит в нашу компетенцию.