Возбудитель туберкулеза и методы диагностики

L – формы микобактерий туберкулеза получены и описаны впервые в 1942 году Alexander – Jackson, в Советском Союзе – в 1972-1974 гг. Шмелевым и Дорожковой. Это дефектные в отношении клеточной стенки или полностью утратившие  ее варианты микобактерий. Для L – форм характерны резко измененная морфология бактериальной клетки и пониженный метаболизм.  Они имеют низкую вирулентность и быстро разрушаются во внешней среде. Из – за отсутствия или повреждения клеточной стенки они не воспринимают обычно применяемые красители для окраски микобактерий, вследствие чего их не удается обнаружить бактериоскопически в мазках из пораженных органов. L – формы микобактерий туберкулеза могут находиться в макроорганизме в стабильном и нестабильном состоянии, т.е. реверсировать в исходный микробный вид с восстановлением вирулентности.

Ультрамелкие L*формы

МБТ. Контрастирование уранил*

ацетатом  и цитратом свинца.

Патогенность  и вирулентность  различных видов  микобактерий 

Под патогенностью микобактерий подразумевается  их способность преодолевать естественные защитные силы организма, проникать  в него, размножаться в нем и  вызывать патологические изменения, а  под вирулентностью  – степень  болезнетворности микобактерий.

Патогенность  микобактерий не является стабильным признаком, а меняется в зависимости  от многих признаков. Так, вид микобактерий, обладающий выраженной вирулентностью для одного вида животных, безвреден  для других.

Механизм  передачи возбудителя 

Перемещения возбудителя туберкулеза от зараженного  организма в восприимчивый здоровый является для него биологической  необходимостью, так как это обеспечивает сохранение возбудителя в природе  как вида. Бесконечное пребывание возбудителя в организме невозможно, т.к. продолжительность жизни животного  ограничена, а сего смертью погибает и возбудитель. Попав из зараженного  организма во внешнюю среду,  возбудитель  лишается естественных условий существования. Микобактерии должны вновь внедриться в организм восприимчивого животного.

Весь  процесс перемещения возбудителя  из зараженного организм в восприимчивый  здоровый называют механизмом передачи. Он состоит из трех фаз: выведение  возбудителя из зараженного животного, пребывание во внешней среде, внедрение  в организм здорового животного. Выведение возбудителя туберкулеза  из организма зараженного  животного  осуществляется при физиологических  процессах (дыхание, молокоотдача, дефекация, мочеиспускание, десквамация эпителия) и при патологических явлениях (кашель, носовые истечения, понос и т.д.). В навозе микобактерии туберкулеза  бычьего вида могут сохранять  жизнеспособность от 5 до 24мес. В труппах  и пораженных органах микобактерии туберкулеза могут выживать до 2мес. и даже до 2 лет. В мясе замороженном, хранящемся в холодильнике, возбудитель  туберкулеза сохраняет жизнеспособность до 1 года, в соленом мясе – до 45-60дн. 

Воздушно*капельная  передача инфекции от больного тубер-

кулезом легких (А) здоровому человеку (Б).

Влияние химических факторов на микобактерии 

Микобактерии  туберкулеза весьма устойчивы ко многим химическим веществам. Их высокая  устойчивость связана со строением  клеточной стенки, которая обеспечивает им механическую осмотическую защиту. Так, в 5-10%-ном растворе соляной и  серной кислот они становятся жизнеспособными  в течение 24ч. В 5%-ном растворе фенола они не погибают в течение 24 ч. 0,5%-ный  раствор этостерила убивает микобактерии туберкулеза в течение 30 мин., 5%-ный раствор карболовой кислоты – в течение 5 ч. и 3%-ный раствор лизола – в течение 1ч. Довольно быстро микобактерии убивают 50-70% алкоголь (Lindner, 1971). Соление и кипячение лишь незначительно обезвреживает микобактерии.

Возбудители туберкулеза довольно чувствительны  к действию кратковолнового УФ излучения, и при облучении их в течение 30с. 

Иммунизирующие  свойства микобактерий 

Со  времени открытия возбудителя туберкулеза  были проведены многочисленные исследования по изучению иммуногенности живых и  убитых туберкулезных и атипичных микобактерий. При использовании в качестве вакцин возбудителя туберкулеза птичьего, человеческого, мышиного видов микобактерий, выделенных из медяницы, водяной черепахи, а также эмульсии, приготовленной из лимфатических узлов туберкулезных животных, были установлены их иммуногенные свойства. Изучение вакцинного штамма микобактерий человеческого вида В-115 показало его высокую остаточную вирулентность. Из штамма «Валле» микобактерий туберкулеза бычьего вида получен новый авирулентный вакцинный штамм «БК - Харьков» 

Диагностика 

1. Бактериологическое  исследование мокроты.  Тинкториальная характеристика возбудителя туберкулеза позволяет производить его быструю идентификацию в клиническом материале, хотя небольшие его количества, присутствующие в исследуемом образце, обусловливают необходимость длительного исследования окрашенных препаратов. Тонкие (менее 0,5 мкм в диаметре), нередко содержащие скопления полихроматических зерен с закругленными концами палочки располагаются в клиническом материале парами или в виде небольших скоплений из нескольких микроорганизмов. Окрашенные флюоресцентным красителем аурамин-родамином микобактерии туберкулеза могут быть обнаружены при микроскопии с обычным (х100) увеличением, но эти условия не дают возможности изучить морфологию возбудителя. Большие возможности предоставляет окраска карболовым фуксином, которая предполагает более длительное исследование препарата с помощью масляной иммерсии (х1000).

Культуральное исследование мокроты дополняет диагностические данные, позволяет провести специфическую идентификацию выделенных кислотоустойчивых микроорганизмов и изучать их лекарственную чувствительность. Время размножения микобактерии составляет от 20 до 24 ч. Первичное выделение возбудителя из клинического материала на классических питательных средах требует от 4 до 8 нед . Радиометрические методы, использующие высокоселективные среды, позволяют получить рост в течение 1 или 2 нед , но идентификация выделенного микроорганизма может потребовать дополнительных затрат времени. Микобактерии — аэробы. Современные методы культивирования микроорганизмов усовершенствованы настолько, что в настоящее время нет необходимости заражать морскую свинку с целью первичного выделения возбудителя. М. tuberculosis обладают способностью продуцировать ниацин , что помогает дифференцировать этот вид от других видов микобактерии. 

2.Серологические  исследования. 

Серологические  тесты для диагностики туберкулеза  используются только в эксперименте и в обычной клинической практике не применяются. В наиболее специфических  серологических реакциях используются высокоочищенные антигены. Иммуноферментативный анализ (ELISA) представляет потенциальную основу для разработки серологических методов диагностики туберкулеза. Он будет иметь наибольшую ценность для диагностики туберкулеза у детей и для диагностики внелегочных форм туберкулеза, когда исследование мокроты нецелесообразно.

3.Рентгенологические  методы  
Рентгенологическое исследование традиционно занимает важное место в диагностике туберкулеза органов дыхания, его результаты обычно позволяют установить предварительный диагноз. Все многообразие специфических изменений, выявляемых у больных, складывается из элементов, схематично представленных на рисунке. Перечисленные элементы могут быть единичными или множественными, заметно варьировать по размерам, морфологии, интенсивности и встречаться в самых разных сочетаниях. При длительном течении туберкулеза рентгенологическая картина может также дополняться признаками пневмофиброза, эмфиземы, бронхоэктазов. Важным для диагностики является наличие остаточных изменений перенесенного туберкулеза: кальцинированных очагов в легких и/или внутригрудных лимфатических узлах. Большую помощь в правильной трактовке заболевания может оказать анализ рентгено-флюорографического архива, поисками которого не нужно пренебрегать.   
 

Уточнение распространенности, морфологических  особенностей поражения органов  дыхания осуществляется с помощью  методов простой и компьютерной томографии, радиоизотопных исследований, эхографии плевральных полостей и субплеврально расположенных образований в легких. 

4.Гистологическая  верификация  
Наличие специфических туберкулезных изменений в материале, полученном при эндобронхиальной, трансторакальной биопсиях, биопсии плевры, торакоскопии, медиастиноскопии (томии), открытой биопсии легкого также является основанием для верификации диагноза туберкулеза. 

Определение антител к МБТ  
 
5. Определение противотуберкулезных антител с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) не имеет самостоятельного диагностического значения, что обусловлено недостаточной чувствительностью и специфичностью метода. В то же время значительное повышение уровня антител к МБТ в крови, определяемое количественным методом, является аргументом в пользу туберкулезной этиологии процесса при анализе результатов комплексного обследования.   

6.Полимеразная  цепная реакция   
Присутствие ДНК МБТ можно установить в исследуемом материале с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая в последние годы стала доступной и используется все шире. Метод обладает высокой чувствительностью – он позволяет обнаруживать возбудитель при содержании всего нескольких сотен микроорганизмов в 1 мл исследуемого материала (мокроты, крови, плеврального выпота и т.д.). Результат исследования можно получить в течение 5–6 ч.  
 
Однако существует ряд причин, препятствующих широкому использованию ПЦР для достоверной верификации диагноза туберкулеза. Предлагаемые отечественные и зарубежные модификации тест-систем для постановки ПЦР значительно различаются по чувствительности и специфичности, что не позволяет получать стандартизированный результат. Этот высокочувствительный метод в ряде случаев может давать ложноположительные результаты, что ограничивает достоверность исследования. ПЦР целесообразно применять в комплексе с традиционными методами лабораторной диагностики туберкулеза. При получении положительного ответа ПЦР, противоречащего результатам других исследований, желательно повторить постановку реакции 

7. Уточнение активности  процесса  
Уточнение активности туберкулезного процесса может потребоваться в случаях, когда в легких на рентгенограмме обнаруживаются характерные для туберкулеза изменения, но отсутствуют бактериовыделение и достоверные признаки активного воспаления. Такая ситуация характерна для пациентов:  
- с ограниченными впервые выявленными изменениями в легких;  
- с остаточными изменениями перенесенного ранее туберкулеза и подозрением на рецидив болезни;  
- при хроническом торпидном течении туберкулеза.  
Изменения гемограммы обычно отражают наличие активного воспалительного процесса (лейкоцитоз, палочкоядерный сдвиг, лимфопения, моноцитоз, увеличение СОЭ), однако они весьма вариабельны, могут отсутствовать у пациентов в начальной фазе ограниченного легочного процесса или быть обусловленными наличием сопутствующих заболеваний (например, обострением хронического бронхита).  
Активность воспалительного процесса при туберкулезе можно уточнить на основании оценки изменений протеинограммы, острофазовых белков, уровня противотуберкулезных антител и антигенов МБТ в крови; состояния клеточного иммунитета; углубленной туберкулинодиагностики с постановкой градуированной туберкулиновой пробы и подкожным введением 50–100 ТЕ туберкулина (проба Коха).

8. Туберкулинодиагностика. Внутрикожная туберкулиновая проба является надежным способом распознавания первичной туберкулезной инфекции. Туберкулиновую пробу обычно ставят в области предплечья. Реакцию следует учитывать через 48—72 ч путем измерения поперечного диаметра уплотнения, выявляемого при легкой пальпации. У больных туберкулезом размер этого уплотнения составляет в среднем 17 мм. Инфицированные, но не заболевшие люди имеют аналогичные реакции.

9. «Хайн-тест». Стрип-тест осуществляет детекцию ДНК МТБ и генетические мутации, ассоциированные с лекарственной резистентностью в мокроте с полоительным мазком или культуре после экстракции ДНК и ПЦР-ампликации. Существуют следующие виды стрип-тестов: 

1. GenoType MTBDRplus – идентификация комплекса M. tuberculosis и его резистентности к рифампицину, иозинамиду в мокроте с положительным мазком и культуре.
2. GenoType MTBDRsl - идентификация комплекса M. tuberculosis и его резистентности к фторхинолонам, аминогликозидам и этамбутолу.

 

1. GenoType Mycobacterium CM/AS - идентификация комплекса M. tuberculosis и 30 наиболее часто встречающихся видов микобактерий в культуре

 

1. GenoType MTBС – дифференциация внутри комплекса M. tuberculosis

 

1. GenoQuick MTB – быстрая молекулярно-генетическая тест-система для обнаружения комплекса M. tuberculosis из клинических материалов пациентов – этот тест наиболее применим к пациентам с подозрением на ТБ, иммуносупрессией или пациентам из стран с высокой распространенностью ТБ. Работает, в том числе, на внелегочных материалах.

 

1. GenoType Mycobacteriа Direct – первый результат до получения культуры позволяет идентифицировать следующие пять микобактериальных видов: M avium, M intracellulare, M kansasii, M mamloense и комплекс M. tuberculosis прямо из декомпенсированных легочных и внелегочных материалов. РНК-базированный GenoType Mycobacteriа Direct тест не был оценен с точки зрения мониторинга лечения пациентов, проходящих лечение от туберкулеза
2. Время диагноза: несколько часов

Автоматизированный

комплекс  ВАСТЕС MGIT 960

для регистрации  роста микобак-

терий и определения их чувстви-