Высокоэффективная жидкостная хроматография и применение ее в фармацевтическом анализе

Сложность технологии прививки реагентов и подготовки сырья и материалов, ее многостадийность приводят к тому, что даже полученные по одной технологии на одной фирме-производителе партии сорбентов могут иметь несколько разные хроматографические характеристики. Особенно это касается тех случаев, когда такие сорбенты используют для анализа многокомпонентных смесей, содержащих вещества, заметно различающиеся по количеству и положению функциональных групп, по роду функциональности.

• Ионообменная хроматография

В ионообменной хроматографии разделение компонентов смеси достигается за счет обратимого взаимодействия ионизирующихся веществ с ионными группами сорбента. Сохранение электронейтральности сорбента обеспечивается наличием противоионов способных к ионному обмену, расположенных в непосредственной близости к поверхности. Ион введенного образца, взаимодействуя с фиксированным зарядом сорбента, обменивается с противоионом. Вещества, имеющие разное сродство к фиксированным зарядам, разделяются на анионитах или на катионитах. Аниониты имеют на поверхности положительно заряженные группы и сорбируют из подвижной фазы анионы. Катиониты соответственно содержат группы с отрицательным зарядом, взаимодействующие с катионами.

 

 В качестве подвижной фазы используют водные растворы солей кислот, оснований и растворители типа жидкого аммиаА, т. Е. системы растворителей, имеющих высокое значение диэлектрической проницаемости и большую тенденцию ионизировать соединения. Обычно работают с буферными растворами, позволяющими регулировать значение рН.

При хроматографическом разделении ионы анализируемого вещества конкурируют с ионами, содержащимися в элюенте, стремясь вступить во взаимодействие с противоположно заряженными группами сорбента. Отсюда следует, что ионообменную хроматографию можно применять для разделения любых соединений, которые могут быть каким-либо образом  ионизированы.

Разделение конкретных веществ зависит в первую очередь от выбора наиболее подходящего сорбента и подвижной фазы. В качестве неподвижных фаз в ионообменной хроматографии применяют ионообменные смолы и силикагели с привитыми ионогенными группами.

• Эксклюзионная хроматография.

Эксклюзионная хроматография представляет собой вариант жидкостной хроматографии, в котором разделение происходит за счет распределения молекул между растворителем, находящимся внутри пор сорбента, и растворителем, протекающим между его частицами.

В отличие от остальных вариантов    ВЭЖХ, где разделение идет за счет различного взаимодействия компонентов с поверхностью сорбента, роль твердого наполнителя   в эксклюзионной хроматографии заключается только в формировании пор определенного размера, а неподвижной фазой является растворитель, заполняющий эти поры. Поэтому применение термина «сорбент» к данным наполнителям в определенной степени условно.

Принципиальной особенностью метода является возможность разделения молекул по их размеру в растворе в диапазоне практически любых молекулярных масс — от 102 до 108, что делает его незаменимым для исследования синтетических и биополимеров.

По традиции процесс, проводимый в органических растворителях, все еще часто называют гель-проникающей, а в водных системах — гель-фильтрационной хроматографией.

Но на практике четких границ нет, так как разделение часто протекает по нескольким механизмам одновременно.

 

 

 

2. По полярности подвижной и неподвижной фаз:

• Нормально-фазовая, неподвижная фаза более полярна, чем подвижная

• Обратно-фазовая, подвижная фаза более полярна чем неподвижная. Причиной сорбции служит сильное притяжение полярных молекул растворителя друг к другу, роль химичкеской природы неподвижной фазы мала, так как взаимодействие сорбат-сорбент ограничивается слабыми дисперсионными силами.

 

6. Качественный анализ.

Качественный анализ применяют для идентификации известного продукта, полученного новым путем или находящегося в смеси с другими продуктами. Он необходим при выделении из сложных биологических, химических смесей различных компонентов, что особенно важно в медицине, криминалистике, экологии, для контроля за нахождением некоторых лекарств и химических веществ и их метаболитов в биоматериалах.

 

 Идентификацию компонентов в ВЭЖХ можно проводить тремя способами:

 

1. использовать информацию об удерживании.

Совпадение значений времени удерживания известного вещества с исследуемым веществом дает возможность предположить их идентичность. Достоверность идентификации возрастает, если проводить сравнение хроматограмм известного вещества и неизвестного компонента в различных условиях. Если вещества в адсорбционной и обращенно-фазной или ион-нообменной и эксклюзионной хроматографии ведут себя одинаково, надежность идентификации возрастает. Если достоверность идентификации при равенстве относительного удерживания составляет 90%, то при изучении поведения этих же веществ в условиях существенно отличающихся достоверность идентификации составляет уже 99%. Ценной характеристикой вещества, применяемой при идентификации,  является    отношение    сигналов,    полученных для данного вещества на двух разных детекторах. Анализируемое вещество после выхода из колонки проходит сначала через первый детектор, затем через второй, а сигналы, поступающие с детекторов, регистрируются одновременно при помощи многоперьевого самописца или на двух самописцах. Обычно применяют последовательное соединение ультрафиолетового детектора (более чувствительного, но селективного) с рефрактометром, или ультрафиолетового с детектором по флуоресценции, или двух ультрафиолетовых детекторов, работающих на разных длинах волн.

 

 

 

 

2. исследовать зоны, полученные при разделении в колонке жидкостного хроматографа, методами спектрального или химического анализа.

В некоторых случаях идентификация неизвестного вещества может быть обеспечена сбором фракции, соответствующей пику хроматографического разделения, и последующим анализом этой фракции физическими или химическими методами. При этом подвижная и неподвижная хроматографические фазы должны быть очищенными, чтобы фон от фазы был сведен к минимуму, они не должны вступать в химическую реакцию с растворенным веществом, должны быть совместимыми-с хроматографической системой, используемой для разделения и обнаружения пика. Неподвижная фаза не должна выноситься из колонки. Кроме того, обе фазы не должны мешать идентификации вспомогательными методами и быть летучими, чтобы их можно было легко удалить выпариванием, фракции обычно собирают вручную, хотя возможно применение коллектора фракций. Для обеспечения чистоты, соответствующей пику собираемой фракции, внутренний объем трубки между детектором и выходом канала для сбора фракций должен быть минимальным. Этот объем должен быть измерен и внесены поправки на задержку между регистрацией пика детектором и фактическим выходом пика из канала для сбора фракций. Фракции удобно собирать в чистые, сухие, защищенные от попадания света сосуды с навинчивающимися крышками и тефлоновыми прокладками во избежание загрязнений. Возможен барботаж этих фракций чистым азотом или гелием.

Растворители удаляют из образца выпариванием, продувкой газом, нагреванием ИК-лампой. Воду и смеси органических растворителей с водой удаляют выпариванием или лиофильной сушкой. Летучие буферные соединения удаляют при повышенных температурах.

 

3. непосредственно подключить спектральный анализатор к колонке.

Разработаны комплексные автоматизированные системы, позволяющие вводить вещество после разделения в колонке хроматографа непосредственно в спектрофотометр, но подобное оборудование является довольно дорогостоящим, требует значительной подготовки оператора и имеет ряд ограничений. Для многих задач применение таких систем нецелесообразно, а иногда даже непригодно. Возможно подключение к жидкостному хроматографу ИК-спектрометра с преобразователем Фурье. При этом химическая структура веществ, соответствующих пикам на хроматограмме, может быть идентифицирована с помощью данных, записанных в библиотеку спектральной информации системы.

 

 

 

 

 

7. Количественный анализ.

Количественная жидкостная хроматография является хорошо  разработанным   аналитическим    методом,  не уступающим по точности количественной  газовой  хроматографии  и  значительно превышающим точность ТСХ или электрофореза. К сожалению, в ВЭЖХ не существует детектора, который имел бы близкую чувствительность для соединений различного химического строения   (как катарометр в ГЖХ). Поэтому для получения количественных результатов калибровка прибора обязательна.

Количественный анализ состоит из следующих стадий:

 

1. хроматографическое разделение.

Нельзя использовать в количественном анализе пики ложные или нечеткой формы, а также пики, время выхода которых близко к t0, поскольку возможно недостаточное их разделение. Наивысшая эффективность колонки достигается при введении 10-5-10-6 г растворенного вещества на 1 г сорбента. При введении больших количеств образца зависимость высоты пика от нагрузки может оказаться нелинейной и потребоваться количественная оценка по площадям пиков. К существенному искажению результатов хроматографического разделения приводят погрешности, связанные с детектированием, или усилением. Каждый детектор характеризуется специфичностью, линейностью и чувствительностью. Особенно важна проверка на селективность при анализе микропримесей. Отклик УФ-детекторов может изменяться на вещества со схожими функциональными группами в 104 раз. Необходимо отклик детектора прокалибровать для каждого определяемого вещества. Естественно, что вещества, не поглощающие в УФ-области, не дадут сигнала на самописец при использовании в качестве детектора фотометра. При использовании рефрактометра возможно появление отрицательных пиков. Кроме того, этот детектор необходимо термостатировать, чего не требуется для УФ-детектора.

 

2. измерение площадей или высот пика;

Высотой пик h называют расстояние от вершины пика до базовой линии, его измеряют линейной либо подсчитывают число делений на самописце. Некоторые электронные интеграторы и вычислительные машины дают информацию о высоте пиков. Положение базовой линии смещенных пиков находят путем интерполирования значений ординат, соответствующих началу и концу пика. Для повышения точности необходимо иметь пологую стабильную базовую линию. В случае неразделенных пиков базовую линию строят между началом и концом пика, а не заменяют нулевой линией. Так как высота пиков менее зависит от влияния соседних перекрывающихся пиков, оценка по высоте пика точнее, и ее почти всегда используют при анализе микропримесей.

Площадь пика можно определять различными способами:

 

2.1. Планиметрический метод  заключается в том, что пик  обводят ручным планиметром, представляющим  собой прибор механически определяющий  площадь пика. Метод точен, но  трудоемок и плохо воспроизводим. Применение этого метода нежелательно.

 

2.2. Метод бумажных силуэтов. Пик вырезают и взвешивают. Метод  хорошо воспроизводим, но трудоемок, при этом уничтожается хроматограмма. Применимость его зависит от  однородности диаграммной ленты. Метод также не может быть  широко рекомендован.

 

2.3. Метод вычисления произведения  высоты пика на ширину на  уровне половины высоты. Его применяют  при четко очерченных и симметричных  пиках. Базовую линию строят так  же, как и при измерении высоты  пика. Для более точного определения  основания на уровне половины  высоты можно увеличить скорость  диаграммной ленты или применить  микроскоп с миллиметровой сеткой. Ширину лучше измерять от внутренней  границы одной линии до наружной  границы другой. Для асимметричных  пиков метод становится менее  точным, так как ширина на уровне  половины высоты может и не  равняться половине основания.

 

2.4. Метод триангуляции  состоит в построении треугольника  путем проведения касательных к сторонам пика. Вершина треугольника находится выше, чем вершина пика. Увеличение площади, образованной этой продленной вершиной, будет последовательным для всей хроматограммы и не слишком повлияет на точность. Кроме того, некоторая площадь, теряемая при проведении касательных, будет компенсирована. Основание треугольника определяют пересечением касательных с базовой линией, а площадь произведением 1/2 основания на высоту. Для определения площадей асимметричных пиков этот метод наилучший. Однако воспроизводимость при построении касательных различными операторами различна и, следовательно, низкая.

 

2.5. Метод с применением дискового интегратора основан на электромеханическом приспособлении, присоединенном к самописцу. Перо, прикрепленное к интегратору, перемещается по полосе внизу ленты со скоростью, пропорциональной перемещению пера самописца. Как и при ручном измерении, пик должен оставаться на шкале самописца, однако регулировки, компенсирующие смещение базовой линии и неполное разделение смежных пиков, снижает надежность и увеличивает продолжительность анализа. Метод более точен, чем ручные методы измерения, особенно при асимметричных пиках, и дает преимущество в скорости. Кроме того, он обеспечивает постоянную количественную запись анализа.

 

2.6. Методы с применением электронных интеграторов, определяющих площадь пиков и печатающих информацию об этой площади и о временах удерживания, могут включать коррекцию смещения базовой линии и определять площадь лишь частично разделенных пиков. Основные преимущества: точность, скорость, независимость действия от работы самописца. Интеграторы имеют память, и их можно программировать для конкретного анализа, используя предварительно заложенную программу. К достоинствам интегратора относят его способность использовать поправочные коэффициенты на отклик детектора при пересчете исходных данных о площадях пиков, компенсируя различие чувствительности детектора к разным веществам. Подобные системы экономят время, улучшают аналитическую точность и полезны для рутинного аналитического анализа.