Синтез нуклеиновых кислот и белков

Терминация. Элонгация цепи продолжается до тех пор, пока рибосома не достигнет терминального кодона (UAG, UAA, UGA). Факторы терминации вызывают отделение «завершенного» полипептида от пептидил -tRNA в Р-сайте.

Элонгация

Посттрансляционная  модификация. Полипептиды, полученные в результате описанного процесса, спонтанно скручиваются, образуя вторичную и третичную конформацию. В клетках животных многие белки синтезируются в виде молекул-предшественников, требующих модификации для приобретения биологической активности. Например, инсулин синтезируется в виде проинсулина и представляет собой одноцепочечную молекулу. После удаления специфическими протеазами полипептидного сегмента он преобразуется в двухцепочечную молекулу с внутри- и межцепочечными дисульфидными мостиками. Присоединение простетической группы с образованием сложных белков и объединение протомеров в олигомерный белок также происходит после завершения трансляции. Известны многие другие посттрансляционные модификации белков. Например, ковалентные модификации, такие как ацетилирование, фосфорилирование и гликозилирование. Кроме того, может происходить модификация аминокислотных остатков, например превращение пролина и лизина в оксипролин и оксилизин в коллагенах, иодирование тирозина в тирео- глобулине и т.д.

Регуляция синтеза белка 

Концентрация многих белков в клетке непостоянна и изменяется в зависимости  от состояния клетки и внешних условий. Это происходит в результате регуляции скоростей синтеза и распада белков. Регуляция экспрессии генов может осуществляться на любой стадии на пути от гена до образования функционально-активного белка.

Регуляция транскрипции

Транскрипция генов может подавляться или активироваться, следовательно, синтез белков может репрессироваться или индуцироваться. Оперон - это участок DNA, кодирующий строение, как правило, функционально связанных белков и содержащий регуляторную зону, контролирующую синтез этих белков. На рисунке приведена схема лактозного оперона:

Регуляция экспрессии Lac-оперона E.Coli

Структурные гены, индуцируемые совместно располагаются на молекуле DNA рядом с последовательностями нуклеотидов, называемых промотором и оператором. Для регуляции транскрипции необходим еще один участок DNA - регуляторный ген, не всегда располагающийся вблизи вышеописанной группы. Во время транскрипции RNA-полимераза связывается с промотором и продвигается вдоль DNA, образуя транскрипт генов оперона. Белки-репрессоры - продукты трансляции регуляторных генов, связывающиеся с соответствующими операторными участками и блокирующие продвижение RNA-полимеразы, и, следовательно, препятствующие транскрипции.

Индукторы. Небольшие молекулы, которые могут связываться с белками-репрессорами и ингибировать их способность связываться с операторными участками DNA. Таким образом, транскрипция может происходить только в присутствии индуктора. Индукторами транскрипции служат субстраты метаболических путей. Они стимулируют синтез белков, обеспечивающих их превращения. Корепрессоры - лиганды белков-репрессоров. Корепрессорами, как правило, являются конечные продукты метаболических путей. Роль индукторов и репрессоров могут играть гормоны.

Регуляция действия генов  и клеточная дифференцировка 

В клетках животных кратковременная  адаптивная индукция и репрессиясинтеза белков возникает при изменении концентрации определенных веществ: субстратов, продуктов метаболических путей, гормонов. Однако существуют также длительные, часто сохраняющиеся на протяжении всей жизни индукция и репрессия, возникающие в ходе клеточной дифференцировки. Разные дифференцированные клетки одного организма имеют одинаковый набор генов, но, как правило, отличаются по белковому составу. Различия клеток при дифференцировке возникают в результате репрессии одних генов и дерепрессии других. Молекулярные механизмы регуляции такого типа недостаточно изучены, но общий принцип действия специфических регуляторов сводится к созданию зон DNA, недоступных для транскрипции за счет конденсации хроматина.

Ингибиторы матричных  биосинтезов 

Использование некоторых лекарственных  средств из группы антибиотиков основано на ингибировании матричных биосинтезов, протекающих в микроорганизмах, вызывающих инфекцию. Например, тетрациклин ингибирует элонгацию, блокируя центр связывания аа-tRNA на рибосоме, эритромицин ингибирует транслокацию. Противобактериальные средства отличаются достаточно высокой избирательностью и мало токсичны для человека. Это объясняется тем, что у бактерий рибосомы в целом, а также некоторые ферменты и белки рибосом отличаются по строению от соответствующих белков эукариот. Противоопухолевые антибиотики (актиномицин D, рубомицин и т.д.) нарушают структуру DNA и ингибируют репликацию DNA и (или) транскрипцию. Лекарственные средства этой группы не обладают абсолютной избирательностью по отношению к DNA опухолевых клеток, поэтому они достаточно токсичны. Однако избирательность в их действии всё же имеется, но объясняется не DNA, а другими факторами, например отличиями проницаемости мембран опухолевых клеток, особенностями метаболизма и т.д.

Генные мутации 

Различные факторы могут нарушать последовательность нуклеотидов в DNA и, следовательно, изменять генетическую информацию. Такие изменения первичной структуры DNA не исправленные репарирующей системой, называются мутациями. Причинами мутаций могут быть: повреждение DNA ультрафиолетом, ионизирующей радиацией, химическими соединениями окружающей среды и, кроме того, ошибки репликации. Генетические мутации ведут к синтезу измененного, дефектного белка. Мутации, затрагивающие регуляторную зону оперона, приводят к нарушению регуляции или прекращению синтеза белка. Выделяют следующие разновидности мутаций:

1. Замена нуклеотида в кодоне. Такое изменение может привести к изменению смысла кодона - миссенс мутации, и появлению в белке новой аминокислоты. Если в результате замены нуклеотида кодон превращается в терминирующий - нонсенс мутации, то синтезируется незавершенный белок, так как его синтез прерывается на этом кодоне. В то же время замена не всегда приводит к изменению смысла кодона. Так как код вырожденный и одна аминокислота кодируется несколькими кодонами, то в результате мутации может получиться новый кодон, но кодирующий ту же аминокислоту.
2. Делеция - утрата мономера из цепи. Может быть утрата фрагмента DNA, состоящего из трех нуклеотидов или количества нуклеотидов кратного трем. В этом случае выпадает один кодон или несколько, а в белке утрачивается одна или несколько аминокислот. Если в DNA утрачивается один мономер (или количество нуклеотидов, не кратное трем), то изменяется смысл всех последующих кодонов. Неполный кодон при считывании дополняется недостающим нуклеотидом из соседнего кодона и «рамка» считывания при транскрипции смещается. В результате такой мутации синтезируется белок со случайной последовательностью аминокислот после места мутации.
3. Вставка дополнительных мономеров. В случае вставки фрагмента из трех нуклеотидов (или количества кратного трем) синтезируется белок удлиненный на одну или несколько аминокислот. Если же в цепь включается один мономер или количество мономеров не кратное трем, то происходит мутация со сдвигом рамки считывания, как описано выше, и синтезируется белок с измененной последовательностью аминокислот после места мутации, не способный выполнять свои функции. Мутации могут быть нейтральными, полезными и вредными. Мутации в половых клетках передаются по наследству и могут проявляться как наследственная болезнь, связанная со структурными и функциональными изменениями белков. Мутации в соматических клетках могут вызывать различные функциональные нарушения, а иногда трансформацию клеток и развитие опухолей. Если в результате мутации свойства белка изменились в лучшую сторону и повышают жизнеспособность организма, то такие мутации биологически полезны и являются средством естественного отбора.

Полиморфизм белков

При филогенезе происходит усложнение генома по двум причинам: удвоение генов и независимые мутации в них. Получаются варианты генов, которые, образовавшись у отдельных особей, распространяются в популяции в результате наследования. Так формируется генетическая неоднородность, ведущая к неоднородности (гетерогенности) фенотипической. Полиморфизм белков обуславливает существование разных форм белка, выполняющего одинаковые или очень сходные функции. Первый тип полиморфных белков связан с увеличением числа локусов кодирующих определенный белок в хромосоме в результате удвоения и мутаций, то есть имеет место группа сходных локусов в геноме индивида. Гены этих белков не аллельны, они занимают разные локусы (HbA, HbA₂, HbF). Второй тип полиморфных белков - продукты аллельных генов (HbA, HbS) - то есть имеет место множество аллелей в генофонде популяции. Полиморфизм белков настолько велик, что можно говорить о биохимической индивидуальности организма.

Методы работы с генным материалом

Трудности в изучении DNA заключаются  в следующем:

1. молекулы DNA животных и человека имеют огромные размеры. Такие молекулы неудобны для исследования и их предварительно разрезают, фрагментируют с помощью специальных ферментов - рестриктаз, выделяемых из бактерий. Рестриктазы «узнают» определенные последовательности и разрезают DNA в определенных местах;
2. количество DNA в клетке невелико, поэтому необходим способ умножения (амплификации) изучаемой DNA in vitro. Таким методом является полимеразная цепная реакция - PCR, которая позволяет амплифицировать DNA или ее фрагмент в миллионы раз за несколько часов.

PCR осуществляют в пробирке с  помощью термостабильной DNA-полимеразы (Tag-полимеразы) при участии дезоксинуклезидтрифосфатов - субстратов и коротких олигонуклеотидных затравок - праймеров. Праймер - это короткие, длиной в 20-30 нуклеотидов одноцепочечные фрагменты DNA, комплементарные 3’-концевым последовательностям копируемой DNA-матрицы. Благодаря праймерам ограничивается фрагмент DNA, который будет скопирован Tag-DNA-полимеразой, присоединяющейся к 3’-концам праймеров и достраивающей их до заданной длины. Реакция происходит в несколько стадий:

Стадии одного цикла PCR

• Денатурация. Инкубационную смесь нагревают до 90^о. При этом происходит разрушение слабых связей в DNA и из одной двухцепочечной молекулы образуются две одноцепочечные.
• Гибридизация праймеров. Температуру снижают до 50^о. При этом происходит гибридизация цепей DNA с праймерами.
• Полимеризация. Инкубационную смесь нагревают до 70^о. При этой температуре Tag-полимераза удлиняет оба праймера с их 3’-концов. Праймеры дорастают до размеров матрицы. В результате количество DNA удваивается. Tag-полимераза выделяется из термофильных бактерий и отличается устойчивостью к высокой температуре. При температуре 70^о гибрид праймер - DNA не денатурирует, а Tag-полимераза способна работать с большой скоростью.

Направления использования PCR

Диагностика болезней (DNA-диагностика). Метод основан на том, что первичная структура DNA разных видов организмов различна. Значит, можно найти последовательности, характерные для DNA возбудителей болезни и подобрать такие праймеры, которые будут гибридизоваться с DNA возбудителя, но не с DNA человека. В этом случае продуктом амплификации будет DNA только возбудителя, а не пациента.

Изучение генома человека. Для этого необходимо выделение и амплификация отдельных генов. Используются праймеры, комплементарные началу изучаемого гена. Последовательность нуклеотидов в таком праймере можно определить по аминокислотной последовательности N-конца и С-конца соответствующего белка и таблице кода. Трудность заключается в том, что код вырожденный и приходится синтезировать несколько праймеров, а затем опытным путем находить праймеры, комплементарные концам гена. Выделение и анализ отдельных фрагментов генов используется для определения мутации и диагностики наследственных болезней.

Клонирование генов 

Фрагменты DNA можно вырезать из генома эукариот специально подобранными рестриктазами и встраивать в DNA плазмиды или вируса вскрытую (разрезанную) теми же рестриктазами. Образуется гибридная плазмида или рекомбинантная DNA. Однако таким способом получается очень небольшое количество рекомбинантной DNA. Клонирование - это способ ее накопления. Для этого рекомбинантные плазмиды встраивают в бактерии и получают рекомбинантные бактерии, которые реплицируют, транскрибируют и транслируют «чужие» гены.

Получение рекомбинантной DNA

Из бактериальной массы можно  выделить достаточное количество рекомбинантной DNA.

Схема синтеза препроинсулина в  трансформированных клетках E.Coli.

Плазмиды кольцевые, двухцепочечные молекулы DNA, содержащиеся в бактериальных  клетках и способные к репликации и транскрипции, независимо от клеточных хромосом.

Обратная транскриптаза (RNA-зависимая DNA-полимераза) - фермент, катализирующий синтез DNA, используя в качестве матрицы RNA. Этот фермент необходим для получения последовательности DNA, комплементарной mRNA (kDNA), применяемой в генной инженерии. С помощью обратной транскриптазы можно получить kDNA- копии mRNA, в которой отсутствуют интроны. Следовательно, при включении в плазмиды эта молекула не подвергается сплайсингу. Рекомбинантные микроорганизмы нашли практическое применение как продуценты необходимых человеку веществ: белковых гормонов, биологически активных пептидов.

Белки иммунной системы 

Иммунная система человека - это  согласованно функционирующая система  молекул и клеток, распознающих и  удаляющих чужеродные вещества. За иммунитет отвечают В- и Т-клетки. В-клетки вырабатывают антитела - иммуноглобулины (Ig). Т-клетки могут убивать чужеродные клетки или собственные, инфицированные вирусом, и могут быть регуляторами иммунного ответа. Каждая молекула антитела представляет собой белок, имеющий форму буквы Y и состоящий из двух идентичных тяжелых (H) цепей и двух идентичных легких (L) цепей.

Строение иммуноглобулинов: а - пептидные  цепи иммуно-глобулинов (Н - тяжелые, L - легкие); пунктиром обозначены вариабельные области; б - молекула IgM, пять мономеров  связаны дисульфидными связями; в - комплексы антиген-антитело.

Существует пять классов антител, имеющих различные константные области Н-цепи. С любым типом Н-цепей могут быть связаны L-цепи любого типа. Каждая L- и Н-цепь Ig состоит из вариабельной области на N-конце и расположенной за ней константной области. Вариабельность аминокислотной последовательности N-концевых участков, как Н - так и L-цепей обеспечивает структурную основу для разнообразия антигенсвязывающих участков. Н-цепи образуют Fc-область («хвостовую») антител. Разные Н-цепи придают «хвостовым» областям антител различную конформацию, от которой зависит дальнейшая судьба комплекса антиген-антитело. От того, с какими белками будет связываться Fс-область Н-цепей, зависят свойства и функции данного класса Ig. Fc-область Ig может связываться не только с фагоцитирующими клетками, но и с первым компонентом системы комплемента, в результате чего активируется та особая система белков крови, которая способствует разрушению антигена.